Что такое биологический объект фиксированный
А то я уже замучилась, не могу ничего в Интернете найти.
Препараты, которые можем видеть своими глазами.
Главным прибором этого метода является световой микроскоп.
Какие объекты удобнее рассматривать с помощью ручной лупы, штативной лупы, светового микроскопа, электронного микроскопа?
Какие объекты удобнее рассматривать с помощью ручной лупы, штативной лупы, светового микроскопа, электронного микроскопа?
Дайте определение термину : спора?
Дайте определение термину : спора.
Помогите?
За ответ даю 45 баллов!
1. Расскажите об устройстве электронного микроскопа.
Во сколько раз он увеличивает изображение объекта?
2. Какие объекты удобнее рассматривать с помощью ручной лупы : штативной лупы : светового микроскопа : электронного микроскопа?
Дайте собственное определение термину полимер?
Дайте собственное определение термину полимер?
Дайте собственное определение терминам монометр?
Дайте собственное определение терминам монометр.
Помогите пожалуйста, задача гигены?
Помогите пожалуйста, задача гигены!
Не могу найти в интернете(.
Дайте определение каждому термину?
Дайте определение каждому термину.
Во сколько раз увеличивает Световой микроскоп Электронный микроскоп?
Во сколько раз увеличивает Световой микроскоп Электронный микроскоп.
Световом микроскопе можно рассматривать объекты С каким максимальным увеличением?
Световом микроскопе можно рассматривать объекты С каким максимальным увеличением.
Мусор, оставленный человеком, обезображивает лицо природы. В замусоренном лесу увеличивается риск возникновения пожара, в частности потому, что стекло, фокусируя солнечные лучи, как лупа, способствует загоранию.
1) Наблюдение 2) Наблюдение 3) Опыт 4) Наблюдение 5) Наблюдение 6)Опыт 7)Опыт.
Цевка ; она не имеет оперения.
Фламинго кудрявого пиликана и другие птицы.
Человек относится к царству животных Ответ : животные.
Изучение фиксированных клеток
Часто для фиксации используются альдегиды и их смеси с другими веществами. В качестве фиксаторов применяют также спирты, вызывающие необратимую денатурацию белков, осаждение нуклеиновых кислот и полисахаридов. Осаждающим действием обладают такие сулемовые фиксаторы и фиксаторы с пикриновой кислотой. Фиксаторы, содержащие четырехокись осмия (OsO4), хорошо сохраняют липиды.
После фиксации объекты в дальнейшем можно подвергать дополнительной обработке. Одной из главных таких обработок является окрашивание клеток. Именно дополнительное окрашивание клеток позволило выявить в них массу деталей.
Стекла с фиксированными мазками одноклеточных организмов или с клетками культуры ткани можно непосредственно помещать в красители. Но для окрашивания клеток в составе органов необходимо получить их срезы. Изучают такие срезы и отдельных клеток.
Для этого после фиксации кусочки органов обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, спирт замещают ксилолом, а ксилол – парафином. Таким образом, фиксированная ткань, минуя высушивание на воздухе, оказывается заключенной в твердую массу парафина, которую можно нарезать.
Срезы толщиной до 5-10 мкм получают на специальном приборе – микротоме. Такие срезы приклеиваются на предметное стекло: парафин растворяется в ксилоле, ксилол удаляется спиртами, которые замещаются водой. Теперь срезы можно окрашивать водными растворами красителей. Для изготовления постоянных препаратов окрашенные срезы снова обезвоживаются и заливаются в канадский бальзам под покровным стеклом, эти препараты можно длительно хранить.
Для окраски фиксированных тканей и клеток применяют различные натуральные и главным образом синтетические красители. Натуральные красители (гематоксилин, кармин и др.) употребляют в сочетании с протравами (окислы различных металлов), с которыми они образуют комплексные соединения (лаки).
Синтетические красители подразделяют на кислые и основные. Основные краски представляют собой соли красящих оснований, содержащие в своем составе аминогруппы, которые и определяют их щелочность. Такие красители образуют солевые связи с кислотными группами в структурах клетки. Следовательно, участки клеток, богатые кислотными группами, свяжутся с основными красителями, будут, как их называют, базофильными. Кислотные красители содержат в своем составе гидроксильные группы, или группы SO2OH. Структуры клеток с основными (щелочными) свойствами связываются с кислотными красителями и называются ацидо- или оксифильными. Существует множество смесей таких красителей, которые одновременно могут окрашивать различные участки клеток в разные цвета и тем самым повышать контрастность клеточных и внеклеточных компонентов. Таким образом, используя всевозможные красители, исследователи не только добиваются четкости морфологической картины клетки, но получают некоторые сведения о химизме той или иной структуры.
Ряд красочных приемов, направленных на выявление специфических химических веществ, получил название гистохимических и цитохимических. Методов цитохимического анализа очень много.
Существует целый ряд специфических красочных приемов, прямо выявляющих те или иные вещества. Это собственно гистохимические (цитохимические) реакции. Основные требования, предъявляемые к такого рода реакциям, следующие: специфичность связывания красителя, неизменность локализации вещества.
Также специфически можно определить локализацию белков реакциями на отдельные аминокислоты (тирозин, триптофан, аргинин и др.). Липиды и жиры обнаруживают в клетках специальными красителями (судан черный), хорошо растворяющимися и аккумулирующимися в жировых включениях.
Целая группа цитохимических реакций связана с обнаружением ферментов. Общий принцип этих реакций в том, что в микроскоп видны не сами белковые ферменты, а места их локализации, которые обнаруживаются по продуктам их специфической ферментативной активности.
Количественную оценку получают не только поглощающие свет объекты и вещества, но и излучающие (светящиеся ). Так, разработаны приемы количественной флурометрии, позволяющие по степени свечения определить содержание веществ, с которыми связываются флуорохромы.
Для выявления специфически белков применяют иммунохимические реакции с использованием флуоресцирующих антител. Этот метод иммунофлуоресценции обладает очень большой специфичностью и чувствительностью. Его можно использовать для выявления не только белков, но и отдельных последовательностей нуклеотидов в ДНК или для определения мест локализации РНК-ДНК гибридных молекул. Для этого сначала на белок (например, тубулин) получают специфические сыворотки, содержащие антитела. Очищенные антитела химически соединяют с флуорохромами. Такие препараты наливают на объекты и с помощью люминесцентного микроскопа по свечению флуорохрома находят места локализации искомых белков в клетке. Однако для того, чтобы меченные флуорохромами антитела проникли в клетку, необходимо плазматическую мембрану сделать проницаемой. Обычно это достигается фиксацией клеток и частичной экстракцией липидов из мембран. Для изучения с помощью этого метода цитоскелетных белков прибегают к растворению клеточных мембран различными детергентами.
Для выяснения локализации мест синтеза биополимеров, для определения путей переноса веществ в клетке, для наблюдения за миграцией или свойствами отельных клеток широко используют метод радиоавтографии – регистрации веществ, меченных изотопами (рис. 9). Принцип этого метода очень прост, он повторяет метод Беккереля, открывшего радиоактивный распад. При радиоавтографическом исследовании клеткам в среду вводится предшественник одного из макромолекулярных соединений (например, аминокислота или нуклеотид), один из атомов которого замещен радиоактивным изотопом. Например, вместо 12 С введен атом 14 С, вместо водорода – тритий 3 Н и др. В процессе синтеза в биополимер включится и меченая молекула предшественника. Регистрировать ее место в клетке можно с помощью фотоэмульсии. Если клетки в пласте или на срезе покрыть фотоэмульсией, то через некоторое время в результате распада изотопа – частицы, разлетающиеся хаотично в разных направлениях, попадут в зону чувствительного фотослоя и активируют в нем зерна бромистого серебра. Чем больше будет время экспозиции, т.е. контакта такой меченой клетки с фотоэмульсией, тем больше зерен AgBr будет засвечено. После экспозиции надо проявить препарат, при этом происходит восстановление серебра только в засвеченных гранулах, при фиксации препарата незасвеченные гранулы AgBr растворяются. В результате из массы гранул, которые покрывали объект, останутся только те, которые были активированы b-излучением. Просматривая в микроскоп такие препараты, поверх которых нанесен слой фотоэмульсии, исследователь находит места локализации зерен серебра, которые располагаются напротив мест, где содержится меченое вещество (рис. 9).
Метод радиоавтографии – один из основных методов, позволяющих изучать динамику синтетических процессов, сравнить их интенсивность в разных клетках на одном и том же препарате. Так, например, с помощью этого метода при использовании меченых предшественников РНК было показано, что вся РНК синтезируется только в интерфазном ядре, а наличие цитоплазматической РНК является результатом миграции синтезированных молекул из ядра.
Метод радиоавтографии используется также для определения расположения определенных типов нуклеиновых кислот или отдельных нуклеотидных последовательностей в составе клеточных ядер или хромосом – метод молекулярной гибридизации. Для этого раствор с меченной нуклеиновой кислотой (например с рибосомной РНК) или с ее фрагментом (например, с сателитной ДНК) наносят на препарат, предварительно обработанный так, чтобы денатурировать ДНК (разорвать водородные связи в нативной ДНК) в составе хромосом или ядер, что достигается щелочной или температурной обработкой образца,. В процессе ренатурации ДНК происходит образование молекулярного гибрида между меченой нуклеиновой кислотой из раствора и комплементарным ему участком ДНК в препарате. Место такой гибридизации определяется радиоавтографически. Этот метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот позволяет с большой точностью локализовать на хромосоме места с данной нуклеотидной последовательностью или даже расположение определенных генов.
Метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот используется также при окраске их флуорохромами. Например, если выделенную ядрышковую ДНК, ответственную за синтез рибосомных РНК, предварительно связать с каким-либо флуорохромом, то после проведения ренатурации ДНК на препаратах с этой флуоресциирующей рибосомной ДНК, можно видеть, что флуоресценция будет наблюдаться только в ядрышках интерфазных клеток или только в зонах ядрышковых организаторов митотических хромосом. Таким образом можно в клетках локализовать любые последовательности ДНК и даже расположение в ядрах отдельных хромосом. Этот прием называется FISH-метод (флуоресцентная in situ гибридизация).
Электронная микроскопия
Рассматривая характеристики светового микроскопа, можно убедиться, что единственным путем увеличения разрешения оптической системы будет использование источника освещения, испускающего волны с наименьшей длиной. Таким источником может быть раскаленная нить, которая в электрическом поле выбрасывает поток электронов, последний можно фокусировать, пропуская через магнитное поле. Это послужило основой для создания электронного микроскопа, в котором уже сейчас достигнуто разрешение в 1 А (0,1 нм). По принципу конструкции электронный микроскоп очень сходен с оптическим: в нем есть источник освещения (катод электронной пушки), конденсорная система (конденсорная магнитная линза), объектив (объективная магнитная линза), окуляр (проекционные магнитные линзы), только вместо сетчатки глаза электроны попадают на люминесцирующий экран или на фотопластинку (рис. 7).
Основная часть такого микроскопа представляет собой полый цилиндр (колонка микроскопа), из которого откачан воздух для того, чтобы не было взаимодействия электронов с молекулами газов и окисления вольфрамовой нити накаливания в катоде электронной пушки. Между катодом и анодом подается высокое напряжение (от 50 до 200-5000 кВ), что служит причиной ускорения электронов. В центре анода есть отверстие, проходя через которое электроны формируют пучок, идущий вниз по колонке микроскопа. Линзы электронного микроскопа представляют собой электромагниты, поле которых может изменять путь электронов (как стеклянные линзы изменяют путь фотонов). В конденсорной линзе пучок электронов фиксируется и попадает на объект, с которым электроны взаимодействуют, отклоняются, рассеиваются, поглощаются или проходят без изменения. Электроны, прошедшие через объект, фокусируются объективной линзой, которая формирует увеличенное первичное изображение объекта. Так же как в световом микроскопе, объективная линза определяет его основные показатели. Первичное изображение увеличивается проекционной линзой и проецируется на экран, покрытый люминесцентным слоем, светящимся при попадании на него электронов. Вместо светящегося экрана изображение можно поместить на фотопластинку и получить снимок.
Напряжение, которое используется для ускорения электронов в большинстве просвечивающих (трансмиссионных) электронных микроскопов, достигает 50-150 кВ. При напряжении в 50 кВ электрон обладает длиной волны в 0,05 А, и в этом случае теоретически можно было бы получить разрешение в 0,025 А (d
0,5 l). Однако в современных конструкциях электронных микроскопов достигается разрешение около 1 А из-за недостаточной стабильности напряжения, стабильности тока линз, неоднородности металла магнитных линз и других несовершенств прибора (теоретически возможно еще повысить разрешение электронного микроскопа в 100 раз). Но и достигнутое разрешение огромно (вспомним, что величина О-Н связи в молекуле воды равна 0,99 А): оно сейчас уже в 10 6 раз выше разрешающей способности глаза!
На экранах и фотопластинках электронных микроскопов можно получить увеличение до 50 000 раз, в дальнейшем при фотопечати можно получить еще 10-кратное увеличение, так что конечное увеличение, при котором максимально реализуется разрешение, может достигать 10 6 раз (например, если 1 мм увеличить в 10 6 раз, то он достигнет длины в 1 км).
В настоящее время электронно-микроскопическое изображение с флуоресцирующего экрана с помощью цифровой телекамеры передается прямо в компьютер, где на экране монитора его можно обрабатывать различным образом (изменять увеличение, контрастность изображения, применять денситометрию, плани- и морфометрию отдельных компонентов). Используя принтер можно получить отпечатки полученных изображений.
Поговорим о микроскопах
Помнится, в далеком детстве мне подарили микроскоп «Натуралист» – игрушечный, но таки дающий фиксированное увеличение аж в шестьдесят раз. Состоял он из одной трубки, закрепляемой на пластмассовом футляре, одновременно играющим роль основания. Сколько интересных вещей тогда было пересмотрено через окуляр, подсвеченный тусклым зеркальцем – от листьев водорослей до целого таракана…
Рис. 1. Детский микроскоп «Натуралист» (за неимением лучшего — фото с торговой площадки)
С тех пор прошло более тридцати лет, но о детском увлечении я не забыл. И вот однажды под влиянием приступа ностальгии я решил купить себе такую же игрушку, только чуть посовременнее. Но первый же взгляд на соответствующий раздел Интернет-площадки показал: чего-то я в этой жизни не понимаю. От обилия самый разных устройств, описываемых одним и тем же словом «микроскоп», просто рябило в глазах. И вот вместо пары быстрых щелчков мышкой пришлось плотно сесть и разобраться хотя бы в самых азах современной микроскопии. Результаты ниже.
Предупреждение: обзор не претендует на исчерпывающее описание и рассчитан на энтузиастов-любителей, интересующихся предметом для себя или для детей. Статья не содержит никакой теории, связанной с оптикой, ее в избытке хватает в других материалах.
Типы микроскопов
Существует довольно много самых разных задач, в которых необходимо детально рассмотреть мельчайшие детали объектов – от драгоценных камней и монет до внутренностей живой клетки. От того, что и как нам нужно увидеть, сильно зависят и применяемые методы. Оставим сейчас за кадром самые мелкие объекты типа вирусов или молекулярной структуры вещества и сосредоточимся на более крупных предметах размерами от бактерии и выше. Оптические устройства, применяемые для таких задач, делятся на два больших класса: биологические (компаундные) и стереомикроскопы.
Подробно останавливаться на стереомикроскопах не станем. Замечу только, что, вопреки подсознательным ожиданиям от названия, данный класс устройств предназначен не для создания стереокартинок. Стереомикроскопы используются для обследования сравнительно крупных непрозрачных предметов в отраженном свете: микросхем, камней, насекомых и т.п. Они отличаются сравнительно небольшим оптическим увеличением (40-60-80х, хотя наиболее продвинутые могут иметь даже 200х) и часто снабжены встроенными мониторами либо цифровыми интерфейсами. Источник света находится над образцом. Размеры – от карманных устройств до солидных стационарных установок.
Некоторые стереомикроскопы для промышленных целей даже лишены оптического окуляра и предназначены исключительно для подключения к компьютеру/смартфону через USB/WiFi («цифровые микроскопы»). Такие микроскопы сравнительно дешевы. Если надо как следует рассмотреть таракана, бриллиант или распайку элементов на плате, этот тип устройств для вас. Только помните, что супер-увеличения типа 1600х, которые часто можно встретить в описаниях даже самых дешевых устройств, относятся к цифровому увеличению и даже близко не отражают реальное оптическое. Каково оно? А кто его знает, производители до таких деталей не снисходят.
Рис. 2. Aomekie stereo microscope с увеличением 20х/40х (фото производителя)
Биологические микроскопы
Основной класс устройств, на котором мы сконцентрируемся – то, что называется биологическим микроскопом, в английской терминологии «компаундным» (составным, от compound). Он предназначен для рассматривания тонких прозрачных образцов (срезы тканей, бактерии, микроорганизмы и т.п.) в проходящем свете. Образец подготавливается на предметном стекле, умещаемом на рабочей платформе, источник света – внизу, под образцом.
Следует понимать, что под биологический микроскоп того же таракана засунуть сложно: для мощной оптики, где расстояние между линзой и препаратом составляет буквально десятую долю миллиметра, препарат должен быть очень тонким, плоским и прозрачным, специально подготовленным и, возможно, окрашенным. Обычно это капля или тонкая пленка, размещенная между предметным и покровным стеклом. Под маломощный объектив таракан влезет (фокусное расстояние у них от нескольких миллиметров до нескольких сантиметров). Однако следует озаботиться хорошим внешним источником света и не стоит рассчитывать на высокую глубину резкости: в каждый момент времени вы сможете отчетливо видеть только определенный слой изображения.
Типовой биологический микроскоп состоит из трех частей: механическая платформа (база, предметный столик, устройства наведения и фокусировки), подсветка и оптическая система.
Рис. 3. Микроскоп Celestron (фото производителя)
Механическая платформа
Механическая часть состоит из основания, на которой монтируются все прочие компоненты, и предметного столика, на котором умещается образец. Очень важной частью механики является система, отвечающая за перемещение предметного столика в трех измерениях – именно так образец подводится в точку фокуса неподвижного объектива. Существуют модели, в которых перемещается объектив, но это редкая экзотика. В устройствах начального уровня механика самая примитивная. Подстройка по высоте (фокусировка) есть только грубая (coarse), перемещение образца в плоскости – пальцами.
В более сложных моделях в дополнение к грубой фокусировке появляется тонкая (fine), а также зажим, перемещающий предметное стекло в горизонтальной плоскости (его подвижная сторона имеет характерный вид полумесяца, ее хорошо видно на изображениях устройств). В наиболее простых микроскопах вертикальное перемещение регулируется разными винтами/рукоятками, в более продвинутых они совмещены на одной оси. В микроскопах без тонкой фокусировки есть реальная опасность раздавить как предметное стекло, так и линзу объектива из-за неловкого движения руки.
Материал корпуса – пластик либо металл. Пластик легче, но и хрупче. Обычно он применяется в мобильных моделях, предназначенных для детей либо полевых лабораторий – там, где важно минимизировать вес. Для стационарных микроскопов используется металл: он не только прочнее, но и менее подвержен вибрациям, которые на высоких увеличениях становятся критичными. Вес металлического микроскопа – 3-4 килограмма.
Исторически база микроскопа состояла из неподвижного основания и подвижного кронштейна, позволяющего менять ориентацию микроскопа относительно вертикали. Это было необходимо не только для комфорта работы, но и для получения качественной подсветки. Однако современные микроскопы имеют монолитное основание с фиксированным углом наклона глазных тубусов, что не всегда удобно. Учтите, что от этого угла прямо зависит комфорт вашей шеи во время работы, так что подбирайте устройство с углом, подходящим именно вам.
Рис. 4. AmScope M500 с простейшим предметным столиком без перемещения в плоскости (фото производителя)
Электрические компоненты
Мало подвести образец в точку фокуса, его надо еще и правильно подсветить. Плохая подсветка приведет к слишком темному или, наоборот, пересвеченному неразборчивому изображению, а также к неоднородному освещению поля.
Исторически для подсветки использовалось вогнутое зеркало, расположенное под отверстием в столике. Однако с его помощью сложно добиться качественного равномерного освещения поля зрения, что критично на высоких увеличениях. Также оно накладывает очень серьезные ограничения по размещению микроскопа относительно источника света, а также на сам источник. Такое зеркало сегодня осталось только в самых примитивных устройствах, обычно в полевых либо детских микроскопах, как в показанном в начале статьи «Натуралисте». Иногда, впрочем, оно может поставляться как дополнительная опция, замещающая основной источник света.
Сегодня для подсветки используются разные виды встроенных в основание ламп. До относительно недавнего времени применялись лампы галогенные или накаливания, но они имели свои проблемы. В первую очередь – из-за того, что свет генерировался тонкой нитью, а проецировать его приходилось на круглое поле, что, опять же, создает проблемы с равномерностью. Однако в современных условиях индустрия широко использует LED-источники света, что проблему сняло.
Запитывается подсветка либо от батареек (такие микроскопы особенно хороши для детей, поскольку их можно повсюду таскать с собой), либо проводом от розетки. Если заказываете проводное устройство за рубежом, помните о переходниках для вилки.
Регулировка подсветки выполняется как интенсивностью лампы, так и световым конденсором под рабочим столиком, имеющим диафрагму и линзу для фокусировки света на образце. В недорогих моделях наиболее распространен конденсор Аббе (Abbe condenser) или его модификации, это название можно часто увидеть в описании микроскопа. Для любительских занятий обычно применяется подсветка вида «светлое поле» (в смысле, прозрачные объекты рассматриваются на ярком белом фоне), хотя есть и другие типы: «темное поле», дающее инвертированное изображение, флуоресцентная подсветка и т.п. Конденсор может быть сменным, позволяя получать в одном и том же микроскопе разные типы подсветки.
Попадаются также модели с дополнительной верхней подсветкой, как на картинке ниже (этакий гибрид биологического и стереомикроскопа), но обычно это удел любительских устройств и малых увеличений: мощные объективы, практически втыкающиеся в покровное стекло, попросту заслоняют верхний свет. На практике уже сорокакратный объектив даже при хорошей внешней подсветке почти ничего не видит, а стократный показывает полный мрак.
Обратите, кстати, внимание: микроскоп на картинке не обладает полноценным конденсором, вместо него – только источник света и диафрагма. На столике присутствуют только самые примитивные зажимы-клипсы для предметного стекла, перемещение препарата в плоскости – пальцами.
Рис. 5. Любительский микроскоп Swift SW150 входного уровня с дополнительной верхней подсветкой (фото производителя)
Оптическая система – объективы
Оптическая система состоит из объективов (смотрят непосредственно на образец) и окуляров (eyepiece, прилегают к глазу).
Объективы, непосредственно рассматривающие образец, монтируются на револьверном диске для быстрой их смены. По нынешним временам они имеют четыре типовых диапазона увеличения: 4-5х (сканирующий объектив, обычно служит для грубой наводки на цель), 10-15х (маломощные линзы), 40-60х (высокомощные) и 90-100х и выше (сверхмощные). Объективы с увеличением выше 100х встречается редко и уж точно не в любительских микроскопах.
Первые три типа («сухие») обычно стандартны для всех моделей, даже для детских. Последний тип объективов встречается в более продвинутых моделях и для получения качественного изображения требует специальной техники использования – иммерсионной. Суть в том, что коэффициенты преломления воздуха и стекла разные для разных длин волн (именно на этом основано разложение белого цвета в спектр). Если между образцом и объективом есть воздух, на стократном увеличении проявляется сильная хроматическая аберрация, снижающая резкость вплоть до полной неразборчивости.
Поэтому для сильных (девяностократных и выше) объективов обычно используется техника погружения (иммерсии) передней линзы объектива в специальное масло, имеющее тот же коэффициент преломления, что и стекло. На покровное стекло наносят каплю масла, в которое непосредственно опускается объектив. После исследования масло с линзы смывается. Такие объективы обычно помечаются словом oil. Могут они использоваться и насухо, но добиться высокой резкости в этом случае невозможно. Масло входит в начальный комплект микроскопа с такими объективами, а также может быть куплено отдельно (из натуральных масел идеально подходит кедровое). Масляную иммерсию нельзя использовать с менее мощными объективами, для которых она не упомянута явно.
Что интересно, еще в середине прошлого века иммерсионными были даже объективы 50х, но с тех пор техника заметно продвинулась вперед. Исторически первой иммерсионной жидкостью являлась обычная вода (техника изобретена еще в начале 19 в.), подходящее масло впервые подобрали ближе к концу того же столетия.
Также стократные объективы могут напрямую упираться в покровное стекло препарата. Защита фронтальной линзы обычно выполняется с помощью специальной пружинящей оправы (слово spring в описании объектива). Несколько раз в описаниях также попадалось слово feather вместо spring, хотя найти определение мне так и не удалось. Для любительских исследований такие объективы избыточны как с точки зрения дополнительной немалой цены, так и с точки зрения затрачиваемых усилий. Особой дополнительной ценности в домашних условиях они не представляют.
Рис. 6. Набор ахроматических объективов фирмы OMAX с типичными мощностями 4х, 10х, 40х и 100х (фото производителя). На стократном объективе хорошо видна пружинящая оправа
Оптическая система – окуляры
Сменные окуляры вставляются в тубусы в верхней части микроскопа и имеют свое собственное фиксированное увеличение, например 10х, 16х, 25х. Чем выше увеличение, тем короче окуляр. Очкарикам типа меня надо держать в уме, что, в отличие от фотоаппарата, работа с окуляром микроскопа в очках крайне затруднена: окуляр должен практически прижиматься к глазу. Вынос зрачка (eye relief) у обычных окуляров составляет 7-13 мм, с очками нужны специальные окуляры с высоким выносом (15-20 мм). Однако это особой проблемы не составляет. В любом случае резкость в микроскопе подстраивается под глаз индивидуально. Даже с самой высокой близорукостью в микроскопе можно видеть резкое изображение. Неудобство только в том, что очки все время приходится снимать и надевать.
Окуляры могут быть широкофокусными (помечаются буквами WF, wide focus). Такой окуляр имеет большую ширину поля зрения, что заметно облегчает работу с широкими препаратами.
Также следует упомянуть линзу Барлоу (Barlow lens). Это дополнительная трехслойная линза, помещаемая в тубус оптического прибора перед окуляром и дающая небольшое дополнительное увеличение. Как правило, в комплекте поставки микроскопа можно встретить линзы Барлоу 2х. Это банальный маркетинговый трюк. Дешевые ахроматические стеклянные (или даже, упаси боже, пластиковые) линзы заметно ухудшают качество изображения, а потому при мощном увеличении бессмысленны. При низких же и средних сочетания объектива и окуляра вполне достаточно.
По количеству окуляров микроскопы делятся на классические монокулярные (один окуляр), бинокулярные (два окуляра, чтобы смотреть обеими глазами) и тринокулярные (третий тубус/порт обычно монтируется вертикально и служит для подсоединения фото- или видеокамеры).
Наиболее прост в использовании монокуляр. К нему очень легко привыкнуть, а проблему он создает единственную – сильную нагрузку на один глаз при расслабленном другом. При долгом использовании это может кончиться неприятными последствиями для зрения.
Бинокулярные микроскопы используются для обоих глаз сразу и создают стереоизображение. Они позволяют регулировать расстояние между окулярами для подгонки под свои зрачки. Также один из тубусов бинокуляра содержит регулировку, позволяющую компенсировать разницу в диоптриях между глазами. Следует держать в уме, однако, что создание цельного изображения при использовании бинокуляра гораздо сложнее, чем с монокуляром, к нему следует привыкать. Кроме того, регулировка имеет свои ограничения по расстоянию между зрачками, так что подстройка под ребенка может оказаться невозможна. Детский микроскоп следует брать монокулярный, да и для эпизодических любительских упражнений бинокуляр особо не пригодится.
Тринокулярные устройства выглядят эффектно и удобно, если речь идет о трансляции изображения наружу одновременно с работой. Однако следует учитывать, что не всегда все три порта могут использоваться одновременно. Встречаются решения, в которых, например, приходится выбирать между одним из глазных тубусов и третьим портом.
Рис. 7. Тринокуляр Omax M837ZL с вертикальным портом для камеры (фото производителя)
Оптическая система – заключение
Суммарная мощность биологического микроскопа вычисляется как произведение увеличений окуляра и объектива. Например, с объективом 40х и окуляром 10х общее увеличение составит 400х. Однако следует учитывать, что для стандартных ахроматических линз добиться четкого изображения на сверхмощном увеличении из-за законов оптики практически невозможно. Начиная с определенного момента, линзы будут только увеличивать уже видимые детали, но не добавлять новые. Максимальное эффективное оптическое увеличение составляет примерно 1500х, а то и меньше, в домашних условиях 1000х – практический потолок. Для более высоких разрешений применяются дорогие апохроматические линзы либо электронные микроскопы, что уже совсем другая песня.
Вообще 1000х – много это или мало? Размер золотистого стафилококка – около 1 мкм (1/1000 мм), амебы – 200-600 мкм, одноклеточной водоросли – около 40 мкм. Тысячекратного увеличения вполне хватит, чтобы разглядеть все это с подробностями. Так что не обращайте особого внимания на маркетинговые цифры максимального увеличения 2500-3000х, получаемого тупым перемножением максимальных мощностей объективов и окуляров. Установить вы его установите, только в результате получится как в песне «Сиреневый туман под линзой проплывает…»
При работе с препаратами также важна правильная установка диафрагмы конденсора. Узкая диафрагма повышает контрастность и резкость, но затемняет изображение. Широкая диафрагма пропускает больше света, но может сделать изображение пересвеченным и малоконтрастным, скрывая детали и даже целые объекты. Подбор диафрагмы для каждого препарата выполняется индивидуально.
На картинке ниже обратите внимание на вращающуюся головку микроскопа, позволяющую ориентировать окуляры в нужном направлении. Такая конструкция удобна при работе нескольких человек. Однако подстраивать резкость под свои глаза каждому все равно придется индивидуально.
Рис 8. Бинокулярный микроскоп Motic BA80 (фото производителя). Под столиком в центре хорошо виден конденсор, на столике – месяцевидный зажим для предметного стекла
Оптическая система – сопряжение микроскопа с компьютером
Подключение микроскопа к внешним устройствам, таким как монитор или компьютер, выполняется за счет установки специальной видеокамеры *вместо* окуляра или в выделенный порт тринокуляра. Следует держать в уме, что в этом случае теряется увеличение, даваемое окуляром, остается только увеличение объектива и нерегулируемых линз камеры. В параметрах камер обычно указывается только емкость ее матрицы (3, 5, 10 и более мегапикселей), оптическое увеличение остается тайной за семью печатями. Кроме того, поле зрения камеры существенно уже, чем у человеческого глаза.
Сама по себе камера может не распознаваться стандартными средствами Windows и приложений (и не надо – без микроскопа она полностью слепа), так что производители прилагают к ней специализированный софт. Он позволяет как делать фотографии, так и записывать видео. На рынке есть разные виды камер – от стареньких с разрешением 640х480 до современных с разрешением аж до 20 мегапикселей. Отличаются они также интерфейсами, что влияет на возможности записи видео в первую очередь (получение видеопотока с высоким FPS и разрешением через USB 2.0 будет затруднительно). Также камеры могут подключаться напрямую к монитору или иному устройству через HDMI, иметь WiFi-интерфейс и т.п.
Многие производители предлагают для своих микроскопов также и камеры, но никто не мешает купить камеру от другого вендора. Следует только учитывать, что диаметр тубуса у разных микроскопов может отличаться, так что следует удостовериться, что данная камера подходит для данного тубуса. Ну, или использовать переходники, которые тоже продаются. Стандартный диаметр для окуляра биологического микроскопа – 23,2 мм, стереомикроскопа – 30 и 30,5 мм.
Существуют также относительно дешевые насадки, позволяющие перенаправлять оптический поток из окуляра в объектив камеры смартфона. Плюс такого устройства – сохранение оригинального увеличения, поскольку монтируются они поверх окуляра. Минус – возможности получения и сохранения изображения ограничиваются невеликими возможностями смартфона. Ну, и поле зрения у такой камеры все равно уже, чем у глаза.
Рис. 9. Цифровая камера для микроскопа Puls Life Science DCM-310 (фото производителя)
Цены и производители
Цены на биомикроскопы можно найти самые разные. Те, что позиционируются для детей, попадаются и за 30-40 евро, однако следует помнить о возможных ограничениях типа фиксированного окуляра 10х, не поддерживающего установку камеры, отсутствия конденсора, а то и вообще подсветки, примитивном предметном столике и т.п. В Европе можно купить монокулярные микроскопы с тремя объективами, рассчитанные на энтузиастов и студентов, их ценовая категория – от 100 евро. Камера для микроскопа – от 50 евро (и далее в космос: двадцатимегапиксельная может стоит и семь сотен). Более профессиональные микроскопы – би- и тринокуляры со стократными объективами – стоят от 250 евро. Наконец, многие вендоры предлагают комплекты, специально рассчитанные на детей, студентов и энтузиастов. В них могут входить монокуляр входного уровня, простенькая видеокамера, базовый набор инструментов и предметных стекол и т.п. Цены на такие комплекты начинаются от полутора сотен евро.
К покупке следует обязательно добавить минимум один набор из предметных и покровных стекол (от 8-10 евро – учтите, это расходный материал), а также, по желанию, набор заранее подготовленных препаратов (крылья, ноги, хвосты, листики и подобные нехитрые препараты для вхождения в тему). Ну, а дальше – скальпели, пинцеты, микротомы, чашки Петри, пробирки, препараторские иглы и так далее, и тому подобное в зависимости от ваших увлечений. Также обязательно купите изопропиловый спирт (чем выше концентрация, тем лучше), кисточки, продувки, салфетки из микрофибры и т.п. – оптика имеет свойство пачкаться и пылиться, а даже отдельные пылинки на линзах микроскопа отобьются пятнами на изображении.
Учитывайте также, что цены на одни и те же товары на американском, английском и немецком Амазонах, не говоря уже про eBay, могут очень существенно различаться, так что после выбора модели стоит порыться на разных площадках в поисках цены пониже. Также можно искать микроскопы на Алиэкспрессе. Однако хотя там цены заметно ниже, чем в Европе, цена на доставку оказывается сопоставима с ценой самого микроскопа, что полностью лишает затею смысла.
Какой бренд выбрать? Поскольку оптика для микроскопов критично важна, на этом рынке отметились крупные мировые производители, связанные с оптикой – Олимпус, Цейс, Лейка, Никон и так далее. Однако цены на их устройства даже входного уровня, мягко говоря, не радуют, да и в розницу они могут просто не работать. Так что любителю стоит приглядеться к более демократичным вендорам, таким как Swift, Bresser, Omax или AmScope. Также можно приобрести отдельные объективы и окуляры, в том числе китайского производства (есть неплохие, судя по отзывам), но в этом случае нужно удостовериться что они совместимы с микроскопом. Европейский стандарт, определяющий резьбу и прочие механические и оптические параметры, называется DIN.
Немного практики. Игрушка в реальности
После месяца мучительных раздумий, в которых детское «хочу!» отчаянно боролось с взрослой скупостью и рационализмом, я остановился на бинокуляре Swift 350B. Почему? Ничего особенного: микроскопы Swift при умеренных ценах имеют качество, подходящее даже для лабораторных условий. Плюс на осенней распродаже на английском Амазоне эта модель продавалась всего за 160 фунтов. Чтобы два раза не вставать, вторым компонентом покупки стала трехмегапиксельная камера Swift стоимостью 80 фунтов.
Выглядит комплект поставки микроскопа примерно так:
Четыре объектива (4х, 10х, 40х и 100х) уже установлены в револьверное кольцо, наборы окуляров (10х и 25х) вложены отдельно. Обратите внимание на пустую вертикальную выемку над головкой и два пустых гнезда – упаковка универсальна и рассчитана в том числе на тринокуляры. Шнур/гнездо питания – C13/C14, блок питания встроен в основание. В комплект входит простенький пластиковый чехол а-ля «мешок мусорный обыкновенный».
В сборе и с подключением к ПК выглядит так (на мониторе – транслируемое с микроскопа изображение пчелиной ноги):
Теперь посмотрим, как выглядят образцы с разным увеличением при трансляции с камеры. Начнем с препарата листа флокса (поперечный срез) из продаваемого набора образцов. Использованы объективы 4х, 10х, 40х и 100х (без масла).
(4х)
(10х)
(40х)
(100х)
Как видно, без иммерсии стократный объектив ничего внятного не показывает. Сорокакратный показывает, но из-за малой глубины резкости приходится выбирать, какой слой препарата рассматривать. Поскольку вместо окуляра использована оптика камеры, финальное оптическое увеличение я определить затрудняюсь. Для сравнения: на снимке ниже то, что видит камера сотового телефона через окуляр 25х и объектив 4х (итоговое увеличение 100х). Снималось с рук, поскольку держатель для телефона я не купил, отсюда обрезанность по бокам.
Можно предположить, что камера дает увеличение 20-25х, но какова его часть оптическая, а какова цифровая, определить сложно.
Второй препарат – сделанный самостоятельно. Просто капля воды из кухонной раковины под покровным стеклом без какой-либо подготовки. Объективы те же: 4х, 10х, 40х.
(4х)
(10х)
(40х)
Обратите внимание на радужную кайму по границе капли (дугообразная черная линия на втором и третьем снимках). Если на 4х аберраций не видно никаких, то на 10х уже появляется слабое искажение цветов на границах объектов. На 40х радуга становится настолько заметной, что отчетливо видна даже на снимке камеры и заметно ухудшает резкость. Именно для ликвидации такого эффекта стократные объективы погружают в масло.
Для сравнения: что видит камера смартфона через окуляр при с комбинацией 4х * 25х:
Напоследок пара слов о стеклах. Препарат, помимо наблюдаемого объекта, состоит из толстого предметного стекла и тонкого покровного. Предметное стекло кладется на столик, покровное обращено к окуляру. Следует быть чрезвычайно осторожным при работе с покровными стеклами: при толщине 0,13-0,17 мм они имеют весьма острые грани, несмотря даже на специальную их обработку. При неаккуратном обращении они могут запросто распластать вам палец, а то и сломаться в ране. Ни в коем случае не позволяйте работать с ними малым детям, да и подростков тоже следует проконтролировать на начальном этапе.
По окончании работы с препаратом следует либо как следует очистить и обезжирить стекла. Остатки жира и масла приведут к тому, что капля будет не растекаться по стеклу, а разбиваться на еще более мелкие капли, затрудняя рассмотрение. В лабораториях применяются разные методы обезжиривания, но они небезопасны и требуют специальных химикатов, зачастую ядовитых, и оборудования типа вытяжек. В домашних условиях наиболее простой способ – изопропиловый спирт либо получасовое кипячение на медленном огне в растворе 2-5% растворе пищевой соды (примерно чайная ложна на 100 мл). Грязное покровное стекло, скорее, проще выбросить – оно слишком хрупкое и легко ломается. Да и за предметные стекла тоже особо держаться не стоит – это дешевый расходный материал. Иммерсионные объективы от масла чистятся так же, как и любая другая оптика: изопропиловым спиртом на микрофибре.
На этом введение в основы оптической микроскопии закончены. Успехов в самостоятельном плавании.