Что такое биотехнология биобезопасность генная инженерия

3.9. Биотехнология, клеточная и генная инженерия, клонирование.

— это производство необходимых человеку продуктов и материалов с помощью живых организмов, культивируемых клеток и биологических процессов.

Возможности биотехнологии необычайно велики благодаря тому, что ее методы выгоднее обычных: они используются при оптимальных условиях (температуре и давлении), более производительны, экологически чисты и не требуют химических реактивов, отравляющих среду и др.

Объекты биотехнологии: многочисленные представители групп живых организмов — микроорганизмы (вирусы, бактерии, протисты, дрожжи и др.>, растения, животные, а также изолированные из них клетки и субклеточные структуры (органеллы). Биотехнология базируется на протекающих в живых системах физиолого-биохимических процессах, в результате которых осуществляются выделение энергии, синтез и расщепление продуктов метаболизма, формирование химических и структурных компонентов клетки.

Главные направления биотехнологии:

1) производство с помощью микроорганизмов и культивируемых эукариотических клеток биологически активных соединений (ферментов, витаминов, гормональных препаратов), лекарственных препаратов (антибиотиков, вакцин, сывороток, высокоспецифичных антител и др.), а также белков, аминокислот, используемых в качестве кормовых добавок;

2) применение биологических методов борьбы с загрязнением окружающей среды (биологическая очистка сточных вод, загрязнений почвы и т. и.) и для защиты растений от вредителей и болезней;

3) создание новых полезных штаммов микроорганизмов, сортов растений, пород животных и т. п.

Задачи, методы и достижения биотехнологии.

Человечеству необходимо научиться эффективно изменять наследственную природу живых организмов, чтобы обеспечить себя доброкачественной пищей и сырьем и при этом не привести планету к экологической катастрофе. Поэтому не случайно главной задачей селекционеров в наше время стало решение проблемы создания новых форм растений, животных и микроорганизмов, хорошо приспособленных к индустриальным способам производства, устойчиво переносящих неблагоприятные условия, эффективно использующих солнечную энергию и, что особенно важно, позволяющих получать биологически чистую продукцию без чрезмерного загрязнения окружающей среды. Принципиально новыми подходами к решению этой фундаментальной проблемы является использование в селекции генной и клеточной инженерии.

Генная (генетическая) инженерия —

раздел молекулярной генетики, связанный с целенаправленным созданием новых молекул ДНК, способных размножаться в клетке-хозяине и осуществлять контроль за синтезом необходимых метаболитов клетки.

Возникнув на стыке химии нуклеиновых кислот и генетики микроорганизмов, генная инженерия занимается расшифровкой структуры генов, их синтезом и клонированием, вставкой выделенных из клеток живых организмов или вновь синтезированных генов в клетки растений и животных с целью направленного изменения их наследственных свойств.

Для осуществления переноса генов (или трансгенеза) от одного вида организмов в другой, часто очень далекий по своему происхождению, необходимо выполнить несколько сложных операций:

выделение генов (отдельных фрагментов ДНК) из клеток бактерий, растений или животных. В отдельных случаях эту операцию заменяют искусственным синтезом нужных генов;

соединение (сшивание) отдельных фрагментов ДНК любого происхождения в единую молекулу в составе плазмиды;

введение гибридной плазмидной ДНК, содержащей нужный ген, в клетки хозяина;

копирование (клонирование) этого гена в новом хозяине с обеспечением его работы.

Клонированные гены путем микроинъекции вводят в яйцеклетку млекопитающих или протопласты растений (изолированные клетки, лишенные клеточной стенки) и из них выращивают целых животных или растения, в геном которых встроены (интегрированы) клонированные гены. Растения и животные, геном которых изменен путем генноинженерных операций, получили название трансгенных растений или трансгенных животных.

Уже получены трансгенные мыши, кролики, свиньи, овцы, в геноме которых работают чужеродные гены различного происхождения, в том числе гены бактерий, дрожжей, млекопитающих, человека, а также трансгенные растения с генами других, неродственных видов. Трансгенные организмы свидетельствуют о больших возможностях генной инженерии как прикладной ветви молекулярной генетики (например, получено новое поколение трансгенных растений, для которых характерны такие ценные признаки, как устойчивость к гербицидам, к насекомым и др.).

На сегодняшний день методы генной инженерии позволили осуществить синтез в промышленных количествах таких гормонов, как инсулин, интерферон и соматотропин (гормон роста), которые необходимы для лечения ряда генетических болезней человека — сахарного диабета, некоторых видов злокачественных образований, карликовости,

С помощью генетических методов были получены также штаммы микроогранизмов (Ashbya gossypii, Pseudomonas denitrificans и др.), которые производят в десятки тысяч раз больше витаминов (С, В₃, В₁₃, и др.), чем исходные формы.

Клеточная инженерия —

совокупность методов, используемых для конструирования новых клеток. Включает культивирование и клонирование клеток на специально подобранных средах, гибридизацию клеток, пересадку клеточных ядер и другие микрохирургические операции по «разборке» и «сборке» (реконструкции) жизнеспособных клеток из отдельных фрагментов.

В основе клеточной инженерии лежит использование методов культивирования изолированных клеток и тканей на искусственной питательной среде в регулируемых условиях. Это стало возможным благодаря способности растительных клеток в результате регенерации формировать целое растение из единичной клетки. Условия регенерации разработаны для многих культурных растений — картофеля, пшеницы, ячменя, кукурузы, томатов и др. Работа с этими объектами делает возможным использование в селекции нетрадиционных методов клеточной инженерии — соматической гибридизации, гаплоидии, клеточной селекции, преодоления нескрещиваемости в культуре и др.

Клонирование —

метод получения нескольких идентичных организмов путем бесполого (в том числе вегетативного) размножения. Таким способом на протяжении миллионов лет размножаются в природе многие виды растений и животных. Однако сейчас термин «клонирование» обычно используется в более узком смысле и означает копирование клеток, генов, антител и даже многоклеточных организмов в лабораторных условиях. Появившиеся в результате бесполого размножения экземпляры по определению генетически одинаковы, однако и у них можно наблюдать наследственную изменчивость, обусловленную случайными мутациями или создаваемую искусственно лабораторными методами.

Тематические задания

А1. Производством лекарств, гормонов и других биологических веществ занимается такое направление, как

1) генная инженерия

2) биотехнологическое производство

3) сельскохозяйственная промышленность

А2. В каком случае метод культуры тканей окажется наиболее полезным?

1) при получении гибрида яблони и груши

2) при выведении чистых линий гладкосемянного гороха

3) при необходимости пересадить кожу человеку при ожоге

4) при получении полиплоидных форм капусты и редьки

А3. Для того чтобы искусственно получать человеческий инсулин методами генной инженерии в промышленных масштабах, необходимо

1) ввести ген, отвечающий за синтез инсулина в бактерии, которые начнут синтезировать человеческий инсулин

2) ввести бактериальный инсулин в организм человека

3) искусственно синтезировать инсулин в биохимической лаборатории

4) выращивать культуру клеток поджелудочной железы человека, отвечающей за синтез инсулина.

Источник

Биотехнология, биобезопасность и генная инженерия: история вопроса.

Длительный период времени под биотехнологией понимали микробиологические процессы. В широком смысле под термином «биотехнология» обозначают использование живых организмов для производства продуктов питания и энергии. Последние годы двадцатого века знаменовались большими достижениями молекулярной биологии и генетики. Были разработаны методы выделения наследственного материала (ДНК), создания его новых комбинаций с помощью манипуляций, осуществляемых вне клетки, и перенесения новых генетических конструкций в живые организмы. Таким образом, появилась возможность получать новые породы животных, сорта растений, штаммы микроорганизмов с признаками, которые невозможно отобрать с помощью традиционной селекции.

История использования генетически модифицированных организмов (ГМО) в практической деятельности небольшая. В связи с этим существует элемент неопределенности относительно безопасности ГМО для здоровья человека и окружающей среды. Поэтому обеспечение безопасности генно-инженерных работ и трансгенных продуктов является одной из актуальных проблем в этой области.

Безопасность генно-инженерной деятельности или биобезопасность предусматривает систему мероприятий, направленных на предотвращение или снижение до безопасного уровня неблагоприятных воздействий генно-инженерных организмов на здоровье человека и окружающую среду при осуществлении генно-инженерной деятельности. Биобезопасность как новая область знаний включает два направления: разработка, применение методов оценки и предупреждения риска неблагоприятных эффектов трансгенных организмов и систему государственного регулирования безопасности генно-инженерной деятельности.

Генетическая инженерия – это технология получения новых комбинаций генетического материала с помощью манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот, проводимых вне клетки, и переноса созданных конструкций генов в живой организм. Технология получения генно-инженерных организмов расширяет возможности традиционной селекции.

Дата добавления: 2015-06-10 ; просмотров: 3362 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

Источник

Биотехнология. Генная инженерия

Молекулярный биолог Пробирочка расскажет про биотехнологию и все ее аспекты — от становления до прогресса

Автор

Редакторы

Комикс на конкурс «био/мол/текст»: Генная инженерия и биотехнология, будучи одними из главных направлений научно-технического прогресса, способствуют решению разнообразных задач. За счет генной инженерии совершен огромный шаг навстречу новым технологиям. В этой статье будет рассказано об истории открытия, становления и успехов биотехнологии, а также о тех вопросах, над которыми сейчас работают молекулярные биологи и биотехнологи.

Конкурс «био/мол/текст»-2018

Эта работа опубликована в номинации «Наглядно о ненаглядном» конкурса «био/мол/текст»-2018.

Генеральный спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

Спонсором приза зрительских симпатий выступил медико-генетический центр Genotek.

Генная инженерия и биотехнология, будучи одними из главных направлений научно-технического прогресса, хорошо способствуют решению разнообразных задач.

В настоящее время биотехнология способна решить множество проблем медицины и создания пищевых продуктов. Также особая роль биотехнологии отводится в сельском хозяйстве. Ученые занимаются созданием и дальнейшим культивированием трансгенных растений и синтезом средств их защиты.

За счет генной инженерии был совершен огромный шаг навстречу новым технологиям. Однако ее развитие породило множество споров, в том числе и о ГМО. Несмотря на все слухи, польза ГМО явно видна. ГМ-растениям не страшен холод, пестициды или засуха. Помимо этого, использование генномодифицированных организмов может улучшить качество жизни населения стран третьего мира.

Самая главная молекула. Открытие ДНК

Несомненно, молекула ДНК занимает особое место в биологической науке. Ведь ДНК является носителем всей наследственной информации, сохраняет ее и передает следующему поколению. Именно с открытия знаменитой двойной спирали учеными Фрэнсисом Криком и Джеймсом Уотсоном (1953 г.) начался новый виток в истории человеческой культуры — эпоха генетики, молекулярной биологии, биотехнологии и биомедицины.

Значение ДНК колоссально, поскольку во всех живых организмах генетическая информация существует в виде особой структуры — двойной спирали. Рассмотрим ДНК с химической точки зрения. Молекула представляет собой достаточно длинную цепь из строительных блоков — нуклеотидов. А каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, дезоксирибозы (особого сахара) и фосфатной группы.

Язык науки. Генетический алфавит

Двухцепочечная молекула ДНК хранит генетическую информацию, а генетическим кодом называют систему записи последовательности кодируемого белка нуклеотидами в гене.

Между языком генетики и любым другим языком можно для наглядности провести параллель. Как самый обычный текст, написанный, к примеру, на русском или английском языках, описывающий последовательность действий, так и запись информации в гене о последовательности аминокислот белка состоит из логически упорядоченных букв. То есть вся генетическая информация в молекуле записана набором из четырех букв — так называемым «алфавитом». Нуклеотиды обозначаются буквами А (аденин), Т (тимин), Ц (цитозин) и Г (гуанин). Они одинаковы у всех — от бактерий до человека. Различной будет лишь последовательность этих букв.

Свойства генетического кода:

Кольцо и спираль. Разнообразие форм

После открытия структуры ДНК началось активное развитие молекулярной биологии. Тем не менее, понимая строение ДНК на уровне химической структуры, никто не мог представить, что эта молекула может быть кольцевой. Как теперь известно, кольцевую ДНК имеют бактерии. Но кольцевая молекула есть и у человека, она находится в митохондриях.

Кольцевое строение ДНК наиболее эффективно для ее удвоения, то есть репликации. Репликация кольцевого типа — относительно простой процесс удвоения молекулы. Происходит разделение цепочек исходной молекулы и наращивание по принципу комплементарности новых цепочек по существующим. В результате получаются дочерние ДНК, которые окажутся идентичными копиями исходной. При кольцевом строении молекулы процесс удвоения протекает более точно.

Роль биотехнологии. Правда о ГМО

Переход биологии на молекулярный уровень дал начало развитию биотехнологии. Ее суть состоит в использовании методов генной инженерии для рыночного производства значимых биологических продуктов: новейших лекарств, реагентов для научных исследований и продуктов питания.

Для создания всего вышеперечисленного используют рекомбинантные белки. Это такие искусственно созданные и обладающие новыми свойствами белки, синтез которых контролируют новые гены, внедренные в клетки.

Рекомбинантные ДНК

ДНК — главный материал, с которым работает генный инженер. Но проверять результаты работы и производить рекомбинантный продукт придется с помощью живых организмов. Так, при создании рекомбинантных ДНК нельзя обойтись без кишечной палочки, которая подходит для производства некоторых биотехнологических продуктов. А при работе с эукариотическими генами и белками часто используют пекарские дрожжи. Главная особенность дрожжей — отличная способность к гомологичной рекомбинации. Дрожжи также удобно использовать при производстве рекомбинантных белков, так как они умеют редактировать матричную РНК, их продукты лишены токсичности, а у некоторых видов достаточно высокий выход продукта.

Вышеуказанные микроорганизмы стали моделями для изучения молекулярной организации и отработки генетических техник у прокариот и эукариот. Для обеспечения техники безопасности и удобства работы с рекомбинантными ДНК были созданы различные мутанты кишечной палочки. К примеру, следующие:

Для генных инженеров эта бактерия особо значима, так как:

Однако у кишечной палочки есть и ряд недостатков:

Постепенно увеличивалось влияние биологии на быт и жизнь человека в целом. Это привлекло к ней всеобщее внимание. Рост возможностей современной биотехнологии породило множество споров, в том числе и о ГМО.

Интересный факт

Человечество тысячи лет вмешивается в эволюционные процессы, проводя искусственный отбор организмов с полезными, значимыми для человека спонтанно возникшими мутациями — селекцию. К примеру, когда-то всем известной кукурузы (в современном понимании) и вовсе не существовало. Древние люди занимались скрещиваниями дикого родственника нынешней кукурузы — теосинте. И как выяснилось в результате исследований, геномы теосинте и кукурузы оказались уж очень схожими. Разницу между двумя видами определили несколько десятков генетических мутаций.

Многих пугает даже сама аббревиатура «ГМО», ведь каждый вкладывает в нее какой-то свой смысл, а у многих она ассоциируется с чем-то злым, опасным и даже смертоносным. Вероятнее всего, ГМО нагоняет страх на людей из-за непонимания, что же это такое.

ГМО — это организмы, геном которых был изменен при помощи генетической инженерии. Тем не менее факт остается фактом: за счет эволюционных процессов гены изменяются сами по себе у всех живых организмов. Отличие лишь одно: в процессе эволюции мы не можем контролировать процесс изменения генома, а в лаборатории, используя современные знания и технологии, способны изменять и улучшать гены.

Кстати говоря, у ученых-генетиков нет ни стимулов, ни целей создавать что-либо угрожающее здоровью всего человечества. Специалисты стремятся продвигать научный прогресс и производить те продукты, которые будут нужны людям.

Современная биотехнология. Генная инженерия сегодня

На данный момент перед учеными стоит ряд технологических задач. Можно изменить биологические организмы с помощью генноинженерных и клеточных методов для удовлетворения потребностей человека. К примеру, улучшить качество продуктов, получить новые виды растений и животных, придать различным живым организмам улучшенные свойства и создать необходимые лекарственные препараты за счет методов генетической инженерии.

Несомненно, в биотехнологии важное место занимает генная инженерия, позволяющая «кроить и шить» геномы подопытных организмов. Роль биотехнологии очень велика, поскольку ее способами производят генноинженерные белки (интерфероны, вакцины против серьезных заболеваний), вещества для фармакологии (лекарства, антибиотики, гормоны, антитела). А различные ферментные препараты применяют в производстве стиральных порошков, спирта. Особая роль биотехнологии — синтез средств для защиты растений и создание трансгенных растений

Трансгенные растения: вред или польза?

Люди могли изменять ДНК растений на протяжении многих лет. Скрещивая друг с другом растения с самыми лучшими свойствами, специалисты замечали, что эти свойства будут сохранены в потомстве. Так зародилась селекция.

Работа специалистов-селекционеров упростилась, когда в науке стали применять генетические законы Грегора Менделя. Позже было обнаружено, что возможно улучшить необходимые свойства растений при помощи мутаций. Число этих мутаций можно увеличивать за счет химикатов и рентгеновских лучей. В результате таких экспериментов было получено огромное количество разнообразных сортов растений. Важно знать, что такой метод может дать непредсказуемые результаты, поскольку, как известно, мутации спонтанны.

Конечно, из различных источников информации можно узнать о предполагаемом вреде трансгенных растений. И на второй план уходит одна из главных задач трансгенных организмов — спасение от нехватки важных питательных веществ и голода населения Земли. Существуют такие трансгенные растения, за счет которых удалось спасти человеческие жизни. Хорошим примером послужит золотой рис.

Золотой рис — генетически модифицированный сорт посевного риса, в зернах которого содержится огромное количество бета-каротина. Эти зерна имеют золотисто-желтый цвет. Считается, что это первая сельскохозяйственная культура, которая целенаправленно генетически модифицирована для улучшения пищевой ценности.

Вообще, при обширном выращивании, золотой рис может в несколько раз улучшить качество питания во многих странах (в том числе и в ряде стран третьего мира), где наблюдается нехватка витамина A. В организме человека витамин A производится из бета-каротина, который поступает преимущественно с растительной пищей. Для модификации риса использовали два гена: ген цветка нарцисса и ген бактерии Erwinia uredovora.

Разумеется, сегодня человечество нуждается в развитии новых технологий, а также ресурсов для жизни, удовлетворяющих потребности организма. Инновации вызывают опасения: сейчас некоторые люди не доверяют современным достижениям генетической инженерии.

Все же важно понимать, что новое — не обязательно плохое, всего лишь нужно попытаться разглядеть и положительные стороны, узнать больше о новых достижениях, открытиях, сделать последующие выводы исключительно на основе достоверных фактов. Именно тогда человечество может отграничиться от ряда споров, заблуждений, встать на путь новейших биологических открытий, сделать огромный рывок вперед.

Источник

Генетическая инженерия. Основы, история, биотехнология

» data-shape=»round» data-use-links data-color-scheme=»normal» data-direction=»horizontal» data-services=»messenger,vkontakte,facebook,odnoklassniki,telegram,twitter,viber,whatsapp,moimir,lj,blogger»>

Генетическая инженерия. Основы, история, биотехнология

5.10. Генная инженерия растений

5.1. ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ

Генетическая инженерия — ветвь молекулярной генетики, ис­следующая возможности и способы создания лабораторным пу­тем (in vitro) генетических структур и наследственно измененных организмов, т.е. создания искусственных генетических программ, с помощью которых направленно конструируются молекулярные генетические системы вне организма с последующим их введени­ем в живой организм. Обычно употребляют два названия данного научного направления — генетическая инженерия и генная инже­нерия, являющиеся как бы синонимами. Однако их смысловое со­держание неодинаково: генетическую инженерию связывают с ге­нетикой, а генная имеет отношение только к генам. Кроме того, генетическая инженерия точнее раскрывает содержание дисцип­лины — создание генетических программ, основная задача кото­рых — создание in vitro молекул ДНК посредством соединения фрагментов ДНК, которые в естественных условиях чаще не со­четаются благодаря межвидовым барьерам (рекомбинантные ДНК). Молекула рекомбинантной ДНК представляет собой соединенные в бесклеточной системе два компонента: вектор, обеспечивающий механизм репликации и экспрессии, и фрагмент клонируемой («чу­жеродной») ДНК, содержащий интересующие исследователя гене­тические элементы. Согласно определению национальных институ­тов здоровья США, «рекомбинантными ДНК называют молекулы ДНК, полученные вне живой клетки путем соединения природных или синтетических фрагментов ДНК с молекулами, способными реплицироваться в клетке». Генетическая инженерия возникла на стыке многих биологических дисциплин: молекулярной генетики, энзимологии, биохимии нуклеиновых кислот и др. Первая рекомбинантная ДНК получена в 1972 г. (П. Бергом с сотр.) и была со­ставлена из фрагмента ДНК обезьяньего вируса ОВ40 и бакте­риофага X dvgal с галактозным опероном Е. coli. Формально 1972 г. следует считать датой рождения генетической инженерии.

Генетическая инженерия имеет яркую историю благодаря тому общественному резонансу, который она вызвала с самых первых своих шагов. Начало этим событиям положило послание участни­ков Гордоновской конференции (1973) президиуму АН США, в котором говорилось о возможной опасности технологий рекомбинантных ДНК для здоровья человека. Возможные блага генети­ческой инженерии признавались с самого начала, но разногла­сия по данной проблеме не затихли и сейчас. В табл. 5.1 перечисле­ны основные этапы становления и развития генетической инже­нерии.

Таблица 5.1 Основные этапы развития генетической инженерии

5.4. ЭКСПРЕССИЯ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ

Эффективность функционирования бактериальных генов не одинакова, что обусловливает вариабельность концентрации от­дельных белков в зависимости от их функций. Такие вариаций белков, например у Е. coli, обусловлены системой контроля ген ной экспрессии, осуществляемой в основном на уровне транскрипции ДНК, и зависят от количества синтезируемой на данном гене мРНК и активности фермента РНК-полимеразы. Порядок чередовании нуклеотидных последовательностей в промоторном участке структурного гена определяет степень активности РНК- полимеразы и инициацию процесса транскрипции. Бактериальные гены, включенные в геном, как правило, экспрессируются достаточно легко, давая мРНК и белок в силу того, что в сигнальных последовательностях, управляющих процессами транскрипции и трансляции у различных прокариотических организмов, много общих черт. Что касается экспрессии генов эукариот бактериях, то она происходит крайне редко, если не создавать специальные условия, поскольку регуляторные участки эукариот отличны от таковых у бактерий. Регуляторные (сигнальные) участки не узнаются бактериальными РНК-полимеразами, что привода к замедлению транскрипции. При клонировании геномной ДНК, эукариотической клетки экспрессия генов не происходит из отсутствия у бактерий системы сплайсинга. Следовательно, для экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот необходимо, чтобы данные гены находились под контролем прокаритических регуляторных элементов. В связи с этим для осуществления экспрессии эукариотического гена соответствующая кДНК (или синтетическая ДНК), содержащая кодирующую последовтельность, в составе векторной молекулы (например, плазмида присоединяется к регуляторным элементам бактерии – промотор оператору и рибосом-связывающему участку.

Таким образом, в сконструированных промежуточных рекомбинантных ДНК эукариотический ген будет находиться под контролем бактериальных регуляторных элементов. Целесообразй встраивать ген в подходящий вектор для экспрессии, который fсодержит регуляторные элементы, способствующие активной экс­прессии встроенного гена после введения рекомбинантной плаз­миды в бактериальную клетку. Например, к таким эффективным регуляторным участкам принадлежит промотор гена р-лактамазы (ген устойчивости к ампициллину, входящий в состав плазмиды pBR). Промотор гена Р-лактамазы нерегулируемый, а исполь­зование таких промоторов не всегда удобно, так как синтезиро­ванные белки в большом количестве могут блокировать рост бак­терий. В связи с этим целесообразнее использовать регулируемые сильные промоторы, включить которые для синтеза чужеродного белка можно и в том случае, когда получена большая бактериальная масса. В частности, к числу регулируемых сильных промоторов сле­дует отнести термочувствительный промотор pL, который ответ­ствен за экспрессию нескольких генов бактериофага. Белок-репрессор, блокирующий данный промотор, активен при 31 С, но неактивен при 38 С, следовательно, при инкубировании бакте­рий при 31 °С чужеродный ген не экспрессируется и, наоборот, повышение температуры вызывает инактивацию репрессора и вы­сокий уровень синтеза нужного белка.

Последовательность оснований длиной 6 — 8 нуклеотидов, рас­положенная непосредственно перед инициирующим кодоном АУТ у Е. coli, определяет эффективность процесса трансляции. Эта пос­ледовательность представляет собой участок связывания мРНК с рибосомой, и его сдвиг в ту или иную сторону способен умень­шать эффективность трансляции мРНК. По имени исследовате­лей, идентифицировавших этот участок, он был назван последо­вательностью Шайн-Дальгарно. Обычно эту последовательность включают в состав самого вектора вместе с инициирующим кодо­ном на нужном расстоянии. При экспрессии векторов такого типа образуется гибридный белок, в котором несколько N-концевых аминокислотных остатков происходят от источника регуляторных элементов и инициирующего кодона прокариотического гена. Та­кие гибридные белки часто более стабильны; обработка их хими­ческим или ферментативным способом приводит к выделению эукариотической части белка.

Суммарная активность экспрессируемого гена возрастает с ро­стом числа копий рекомбинантной ДНК в расчете на клетку. Ис­пользуя многокопийные плазмиды, можно получить сверхсинтез нужных белковых продуктов. Получены температурно-чувствительные мутантные плазмиды, способные накопить до 1 — 2 тыс. ко­пий на клетку без нарушения жизненно важных функций бакте­рий. Обычно же используемые плазмидные векторы поддержива­лся в клетке в количестве 20 — 50 копий. Получение бактериаль­ных штаммов-сверхпродуцентов плазмидных генов — одна из важ­нейших задач современной биотехнологии в экономическом, ме­дицинском и социальном аспектах.

5.5. КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ В РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНИЗМАХ

В настоящее время разработаны системы клонирования в бактериях, дрожжах, грибах, растениях и млекопитающих. Особый интерес с экономической точки зрения представляют системы В настоящее время разработаны системы клонирования в бак­териях, дрожжах, грибах, растениях и млекопитающих. Особый интерес с экономической точки зрения представляют системы

клонирования генов в грамположительных бактериях, многие из которых являются сверхпродуцентами важнейших химических со­единений. Значительных успехов в биоиндустрии удалось достичь с клетками Bacillus subtilis, стрептомицетами и Saccharomyces cerevisiae.

Векторы для клонирования в таких системах представляют со­бой двойные репликоны, способные существовать ив£. coli, и в той клетке хозяина, для которой они предназначены. С этой це­лью создают гибридные векторы, содержащие репликон какой- либо из плазмид Е. coli и требуемый репликон (из бактерий, дрожжей и др.), и первоначально клонируют с последующим от­бором требуемых генов в хорошо изученной системе. Затем вы­деленные рекомбинантные плазмиды вводят в новый организм. Такие векторы должны содержать ген (или гены), придающий клетке-хозяину легко тестируемый признак.

В. subtilis — непатогенный почвенный микроорганизм. Кле­точная стенка бактерии имеет простую структуру, позволяющую секретировать многие белки в культуральную жидкость. В част­ности, 20 различных видов бактерий синтезируют более 40 фер­ментов с внеклеточной локализацией. В этих бациллах обнаруже­ны плазмиды и фаги, генетика которых хорошо изучена. Клони­рование осуществляется с помощью так называемых челночных векторов, которые способны реплицироваться в клетках несколь­ких хозяев: В. subtilis, Е. coli, Staphylococcus aureus. Векторы были получены комбинацией in vitro фрагментов плазмид St. aureus, Е. coli и хромосомных фрагментов В. subtilis. Полученные рекомби­нантные штаммы несут признаки устойчивости к антибиотикам.

Стрептомицеты широко применяют в биотехнологии в каче­стве продуцентов антибиотиков. Конструирование векторов для клонирования в них началось с выделения плазмиды Scp2 из Streptomyces coelicolor. На основе этой плазмиды были сконстру­ированы векторы, придающие стрептомицетам устойчивость к антибиотикам, например к метиленомицину А.

Клонирование в дрожжах. Среди дрожжей наиболее полно изучен вид S. cerevisiae. У этого вида в гаплоидных клетках со­держится 17 хромосом, в их составе идентифицировано несколь­ко сотен генов. Большинство штаммов дрожжей содержат авто­номно реплицирующуюся кольцевую ДНК длиной 2 мкм. Плаз­мида Scpl S. cerevisiae содержит около 6300 пар оснований и имеет 50— 100 копий на клетку. Ее гибриды с плазмидами обыч­но и используют в качестве векторов. Работа с дрожжами облег­чается тем, что подобно бактериям они могут расти в жидкой сре­де и давать колонии на твердой среде, а также имеют сравнитель­но короткое время регенерации (несколько часов) вследствие ма­лого размера генома.

Процедура выделения ДНК в клетки дрожжей довольно про­ста. Обычно целлюлозную клеточную стенку удаляют обработкой ферментами, получая так называемые сферопласты. Их инкуби­руют с ДНК в присутствии СаС1₂и полиэтиленгликоля. Мембра­на при этом становится проницаемой для ДНК. Дальнейшая ин­кубация сферопластов в среде с агаром восстанавливает клеточ­ную стенку’. Селекция дрожжевых клонов, трансформированных рекомбинантными плазмидами, основана на применении в каче­стве клеток-хозяев определенных мутантов, не способных расти на среде, в которой отсутствует тот или иной питательный ком­понент. Векторная плазмида содержит гены, которые при попа­дании в клетку-хозяина придают ей этот недостающий признак. Трансформанты легко отбираются по их способности давать ко­лонии на обедненной среде. Применяя приемы, аналогичные ис­пользовавшимся при клонировании в бактериях, удается достичь синтеза чужеродных белков в дрожжевых клетках. Эти клетки по­добно В. subtilis секретируют большое количество белка во вне­клеточную среду, что используется также для секреции чужерод­ных белков, например интерферона человека.

Клонирование в клетках животных. Проблема введения ге­нов в клетки млекопитающих очень важна для исследования фун­кционирования генов высших эукариот.

Предварительно клонированные гены вводят в клетку жи­вотных различными путями. Суть одного из них состоит в трансформации клеток требуемым геном, соединенным с од­ним из генов, для которых осуществляется селекция.

Селективные маркеры дают возможность вводить в клетки мле­копитающих любой ген, заранее лигированный с клонирован­ным селективным маркером.

В последние годы сконструировано большое количество так называемых челночных векторов и их рекомбинантных производ­ных, способных к репликации в животной и бактериальной клет­ках, экспрессирующие клонируемый ген в животной клетке. К числу таких векторов можно отнести векторы из плазмиды pBR322 и интактного района транскрипции ДНК SW-40. Геном SW-40 представляет собой циклическую ДНК длиной 5243 п.о. Однако в вирусах животных размеры несущественных областей малы и в них нельзя внедрить большие фрагменты чужеродной ДНК, на­пример ген дигидрофолатредуктазы мыши размером 42 kb. В боль­шинстве случаев чужеродная ДНК замещает существенные гены, в результате чего рекомбинантные вирусы утрачивают способность к репликации. Для ее функционирования используют «вирусы- помощники», синтезирующие продукты недостающих генов, за счет которых и существует рекомбинантный вирус. Обычно опу­холевые вирусы (в том числе SV-40) внедряют свою ДНК в хро­мосому клетки-хозяина и тем самым убивают ее при своем раз­множении. Обычно вирус бычьей папилломы в трансформиро­ванных клетках существует в виде эписомы (=100 копий на клет­ку) и используется в качестве основы для конструирования эписомных векторов. Одна из важнейших задач генной инженерии — разработка технологий по созданию векторов, подобных плазмидам, не убивающим клетку-хозяина и эффективно экспрессирующим клонируемый ген в животной клетке.

Представляют немаловажный интерес микроинъекции ДНК не­посредственно в ядро клетки. Так, плазмиды, содержащие фраг­мент вируса герпеса с геном тимидинкиназы, и плазмиды pBR322 были инъецированы в ТК-клетки, при этом ТК-ген проник в ядра и нормально в них реплицировался.

Трансформация соматических клеток млекопитающих открывает возможность для изучения механизмов регуляции экспрессии генов и целенаправленно модифицировать генетический аппарат клетки животных, в том числе и человека. Культуры клеток млекопитаю­щих могут быть эффективным источником выделения ряда вирус­ных антигенов с целью получения вакцин для животных и человека.

В настоящее время разработаны способы введения генов в эмб­риональные клетки млекопитающих, мух и некоторых растений с целью изменения свойств организма, таких, как скорость роста, устойчивость к заболеваниям и внешним воздействиям. Подобно­го рода работы были начаты с довольно крупными яйцами амфи­бий, а затем продолжены с яйцеклетками и эмбрионами мыши. Микроинъекцию клонированных генов проводят в один или оба пронуклеуса только что оплодотворенной яйцеклетки мыши. После инъекции яйцеклетку немедленно имплантируют в яйцевод приемной матери или дают возможность развиваться в культуре до стадии бластоцисты, после чего имплантируют в мат­ку. Таким образом были инъецированы гены интерферона и ин­сулина человека, ген глобина кролика, ген тимидинкиназного ви­руса герпеса и кДНК вируса лейкемии мышей. Выживает обыч­но от 10 до 30 % яйцеклеток, а доля мышей, родившихся из транс­формированных яйцеклеток, составляет от нескольких до 40 %.

Выяснено, что уровень экспрессии чужеродного гена зависит от места интеграции ДНК с хромосомами, от дифференцировки тканей.

Несмотря на определенные успехи в области интеграции чужерод­ных генов в эмбриональные клетки животных, до сих пор не удалось встроить чужеродную ДНК в заданный участок хромосомы, вытес­нить ген и заменить его новой нуклеотидной последовательностью, подчинить новый ген системе регуляции организма. Преодоление этих трудностей позволит успешно осуществлять гемотерапию чело­века — лечение нескольких десятков генетических заболеваний, обусловленных отсутствием или дефектами генов.

5.6. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ В ЖИВОТНОВОДСТВЕ

Применение методов генетической инженерии в животноводстве открывает перспективу изменения ряда свойств организма: повыше­ние продуктивности, резистентности к заболеваниям, увеличение скорости роста, улучшение качества продукции и др. Животных, не­сущих в своем геноме рекомбинантный (чужеродный) ген, принято называть трансгенными, а ген, интегрированный в геном реципи­ента, — трансгеном. Продукт этого гена (белок) является трансген­ным. Благодаря переносу генов у трансгенных животных возника­ют новые качества, а дальнейшая селекция позволяет закрепить их в потомстве и создавать трансгенные линии.

Получение трансгенных животных предусматривает ряд эта­пов: приготовление раствора ДНК для микроинъекции; извлече­ние эмбрионов из донорных организмов; микроинъекция ДНК и пересадка инъецированных эмбрионов в яйцеводы или после культивирования в матку синхронизированных реципиентов. У родившихся потомков исследуют экспрессию трансгена на уровне транскрипции и трансляции. Трансгенное потомство получают путем использования традиционных методов разведения животных. Следует отметить, что от приготовления инъекционного раствора ДНК (его чистоты, концентрации) во многом зависит эффективность получения трансгенных животных. Обычно гены транспортируют на ранних стадиях развития животного (в боль­шинстве случаев на стадии зиготы и двухклеточных эмбрионов). Для трансформации генов в геном животного используют следу­ющие приемы: микроинъекцию ДНК в пронуклеус зигот или в каждый бластомер у двухклеточного эмбриона; введение ДНК с помощью ретровирусных векторов; получение трансгенных химер из генетически трансформированных клеток и эмбрионов. В на­стоящее время наиболее распространенный метод — микроинъ­екция ДНК. Ее осуществляют с помощью специальной пипетки (внутренний диаметр ее около 1 мкм), а количество инъецирован­ного раствора ДНК составляет 1 — 2 пкл. После инъекции ДНК эмбрионы культивируют до момента пересадки реципиентам. Следует отметить, что микроинъекция эмбрионов сельскохозяй­ственных животных значительно сложнее, чем микроинъекция эмбрионов мышей и кроликов.

После небольшого культивирования in vitro проинъецированные эмбрионы переносят в яйцеводы (хирургическим путем) ре­ципиентов. Каждому реципиенту мыши, кролика и свиньи обыч­но пересаживают 20—30 инъецированных зигот, причем у свиней все эмбрионы трансплантируют в один яйцевод; у мышей и кро­ликов — раздельно по яйцеводам, а у овец, коз и крупного рога­того скота — по 2 —4 эмбриона каждому реципиенту. Используя методы блот-анализа, дот-блот-анализа и полимеразную цепную реакцию (ПЦР), можно получить вполне надежные доказательства интеграции и экспрессии ДНК у трансгенных животных. С этой целью используют ядросодержащие клетки тканей или внутренних жидкостей реципиента, из которых выделяют ДНК.

Для исследования у трансгенных животных выделяют РНК из тех тканей, в которых предполагается наиболее высокий уровень экспрессии. Качественный и количественный анализы экзоген­ных белков позволяют судить об уровне трансляции инъецированного генного материала.

Генетический анализ родившихся трансгенных животных и полученного от них потомства показал, что, несмотря на инъек­цию ДНК на ранних стадиях, в трансгенных линиях могут появ­ляться так называемые мозаики. К мозаикам относят животных, происходящих из одной зиготы, но имеющих разные 1енотипы. Помимо клеточных линий, содержащих трансген, они имеют еще и нетрансгенные клеточные линии. Подсчитано, что около 30% первичных трансгенных животных, полученных методом микро­инъекции ДНК, — мозаики, что затрудняет создание чистых трансгенных линий животных. Этим объясняется тот факт, что трансген не передается потомству с ожидаемой в соответствии с законами Менделя частотой 50 %. Часть мозаиков вообще не может дать начало трансгенным линиям, так как у них отсутствует передача трансгена по наследству.

Одна из важнейших задач сельскохозяйственной биотехноло­гии — выведение трансгенных животных с улучшенной продук­тивностью и более высоким качеством продукции, резистентнос­тью к болезням, а также создание так называемых животных-биореакторов — продуцентов ценных биологически активных веществ. Каковы же успехи биотехнологии в этом направлении? С генети­ческой точки зрения особый интерес представляют гены, коди­рующие белки каскада гормона роста: непосредственно гормон роста (ГР), рилизинг-фактор гормона роста (РФ) и инсулинподобный фактор ГР (ИФГР).

В конце 70-х годов XX в. на основе технологии рекомбинантной ДНК получили гормон роста микробного происхождения. Было показано, то ГР оказывает такое же стимулирующее действие на лактацию и рост животного, как и гипофизарный ГР. Гормон ро­ста, полученный с помощью методов генетической инженерии, при крупномасштабном применении вызывал увеличение удоев на 23 — 31 % при дозе 13 мг в день. Разработаны формы препарата пролонгированного действия, позволяющие использовать его один раз в две недели и даже в месяц. При ежедневной инъекции ГР молодняку крупного рогатого скота, свиней и овец удалось увели­чить суточные привесы на 20 — 30% при значительном сокраще­нии расхода кормов на единицу прироста. У молодняка свиней с ускорением роста увеличивалось содержание белка и уменьша­лось содержание жира в тканях, что повышало качество мясопро­дуктов.

Первые трансгенные мыши с геном ГР были получены в 1982 г. У них отмечалось повышение скорости роста и увеличение конеч­ной живой массы. Однако у трансгенных свиней с геном ГР (1989) увеличение роста не наблюдалось.

По данным Л. К.Эрнста (1996), у трансгенных свиней с геном рилизинг-фактора гормона роста (РФ ГР) конечная живая масса была на 15,7 % выше по сравнению с контрольными животными. У потомства трансгенных свиней, получавших модифицирован­ный кормовой рацион с повышенным содержанием белка (18% сырого протеина) и с дополнительным количеством лизина, от­мечались более высокие среднесуточные привесы (на 16,5 %).

У трансгенных овец с генами ГР и РФ ГР, несмотря на повы­шенный уровень ГР, скорость роста не увеличивалась. Вместе с тем, по данным большинства исследователей, у трансгенных сви­ней наряду с повышением содержания белка наблюдалось дву­кратное уменьшение толщины шпика (7 — 8 мм у трансгенных про­тив 18 —20 мм у контрольных животных); аналогичные показате­ли отмечены у трансгенных овец (25 — 30 % жира у контрольных животных против 5 —7% у трансгенных овец).

Рассматривается возможность уменьшения лактозы в молоке путем создания животных, у которых присутствует специфически для молочной железы промотор, соединенный с геном фермента бета-галактозидазы, катализирующей распад лактозы. Молоко таки животных, не содержащее лактозы, могут использовать люди, которых не синтезируется бета-галактозидаза. Ведутся работы по введению генных конструкций в организм трансгенных животных вырабатывающих антитела, предотвращающие маститы.

Другая важная задача — выведение трансгенных животных, устойчивых к заболеваниям. Потери в животноводстве, вызван­ные различными болезнями, достаточно велики, поэтому все бо­лее важное значение приобретает селекция животных по резистен­тности к болезням, вызываемых микроорганизмами, вирусами, паразитами и токсинами. Пока результаты селекции на устойчи­вость животных к различным заболеваниям невелики, но обнадеживающих. В частности, созданы популяции крупного рогатого ско­та с примесью крови зебу, устойчивые к некоторым кровепарази­тарным заболеваниям. Установлено, что защитные механизмы от инфекционных заболеваний обусловлены либо препятствием втор­жению возбудителя, либо изменением рецепторов. Вторжению воз­будителей, равно как и их размножению, препятствуют в основном иммунная система организма и экспрессия генов главного комп­лекса гистосовместимости. Одним из примеров гена резистентно­сти у мышей служит ген Мх. Этот ген, обнаруженный в модифи­цированной форме у всех видов млекопитающих, вырабатывает у Мх + мышей иммунитет к вирусу гриппа А. Ген Мх + был выделен, клонирован и использован для получения трансгенных свиней, эк­спрессирующих ген Мх на уровне РНК. Однако данные о транс­ляции Мх-протеина, обусловливающего устойчивость трансгенных свиней к вирусу гриппа А, пока не получены. Ведутся исследова­ния в целях получения трансгенных животных, резистентных к маститу за счет повышения содержания белка лактоферина в тка­нях молочной железы. На культуре клеток из почек трансгенных кроликов было показано, что клеточные линии, содержащие транс­генную антисмысловую РНК, имели резистентность против адено­вируса Н5 (Ad_s) более высокую на 90 —98 % по сравнению с конт­рольными линиями клеток. Л. К. Эрнст продемонстрировал также устойчивость трансгенных животных с геном антисмысловой РНК к лейкозу крупного рогатого скота, к заражению вирусом лейкоза.

Показана возможность конструирования системы внутриклеточной иммунизации против инфекционных вирусов с участием мутационных форм эндогенных вирусных белков, защищающих от соответствующих вирусов. Так, получены трансгенные куры, устойчивые к лейкозу, у которых в клетках присутствовал белок вирусной оболочки.

Одна из важнейших задач стратегии использования трансгенных животных в медицине — получение биологически активных соединений за счет включения в клетки организма генов, вызы­вающих у них синтез новых белков.

Трансгенные животные как продуценты ценных биологически активных белков и гормонов имеют ряд преимуществ перед мик­роорганизмами и клеточными системами. Важно, что новые бел­ки, получаемые в линиях клеток трансгенных животных, могут быть модифицированы, их активность сравнима с активностью протеинов. Для молочного производства представляет большой интерес получение целенаправленной трансгенной экспрессии в эпителиальные клетки молочной железы с целью выхода белков с молоком. Один из основных этапов получения трансгенных жи­вотных, продуцирующих гетерогенный белок с молоком, — иден­тификация промотора, направляющего экспрессию структурных генов в секреторный эпителий молочной железы.

В настоящее время выделены гены и промоторы aS1-казеина, бета-казеина, a-лактоальбумина, бета-лактоглобулина и сывороточно­го кислого протеина (WAP). Молочная железа — великолепный продуцент чужеродных белков, которые можно получать из моло­ка и использовать в фармацевтической промышленности. Из мо­лока трансгенных животных извлекают следующие рекомбинан­тные белки: человеческий белок С, антигемофильный фактор IX, a-1-антитрипсин, тканевой плазменный активатор, лактоферин, сывороточный альбумин, интерлейкин-2, урокиназу и химозин. В большинстве проектов, за исключением a-1-антитрипсина и химозина, эти исследования пока еще на стадии разработки и ве­дутся в основном на трансгенных мышах, поэтому оценивать их с точки зрения коммерческого интереса еще рано.

Вышесказанное можно проиллюстрировать следующими при­мерами. В США осуществлен метод микроинъекции ДНК, отве­чающий за экспрессию бета-лактоглобулина, который способен продуцироваться только в молочных железах животных. В Эдинбур­ге в 1992 г. были выведены трансгенные овцы с геном a-1-антитрипсина человека и бета-глобулиновым промотором. Содержание этого белка у разных трансгенных овец составляло от 1 до 35 г/л, что соответствует половине всех белков в молоке. При таком уров­не продукции белка может быть получено около 10 кг трансген­ного белка от одного животного в год, что достаточно для 50 па­циентов при лечении эмфиземы легких. Обычно выход рекомби­нантных белков в системах с использованием культуры клеток со­ставляет около 200 мг/л, а у трансгенных животных он может по­вышаться до 1 л. Следует заметить, что создание клеточных куль­тур и их выращивание в промышленных реакторах, а также вы­ведение трансгенных животных и их обслуживание — дорогие и сложные процедуры. Однако трансгенные животные легко раз­множаются, содержание их сравнительно дешево, что делает этих животных хорошими продуцентами разнообразных белков с низ­кой стоимостью. В России группой ученых под руководством Л. К. Эрнста получены трансгенные овцы с геном химозина, в 1 л молока которых содержится 200 — 300 мг химозина — основного компонента для производства сыра. Стоимость его будет в не­сколько раз ниже продукта, получаемого традиционным способом из сычугов молочных телят и ягнят. Приведены данные, свиде­тельствующие о высокой эффективности производства сыра с использованием химозина молока трансгенных овец. Так, из 3 л молока трансгенной овцы можно получить достаточное количе­ство химозина для производства 1 т сыра из коровьего молока.

Источник