Что такое обратимое и необратимое осаждение белков

Необратимое осаждение белков

Необратимое осаждение белков связано с глубокими нарушениями структуры белков (вторичной и третичной) и потерей ими нативных свойств. Такие изменения белков можно вызвать кипячением, действием концентрированных растворов минеральных и органических кислот, солями тяжелых металлов.

Осаждение при кипячении.Белки являются термолабильными соединениями и при нагревании свыше 50-60°С денатурируются. Сущность тепловой денатурации заключается в разрушении гидратной оболочки, разрыве стабилизирующих белковую глобулу связей и развертывании белковой молекулы. Наиболее полное и быстрое осаждение происходит в изоэлектрической точке (когда заряд молекулы равен нулю), поскольку частицы белка при этом наименее устойчивы. Белки, обладающие кислыми свойствами, осаждаются в слабокислой среде, а белки с основными свойствами – в слабощелочной. В сильнокислых или сильнощелочных растворах денатурированный при нагревании белок в осадок не выпадает, т.к. его частицы перезаряжаются и несут в первом случае положительный, а во втором – отрицательный заряд, что повышает их устойчивость в растворе.

Осаждение концентрированными минеральными кислотами. Концентрированные кислоты (серная, хлористоводородная, азотная и др.) вызывают денатурацию белка за счет удаления факторов устойчивости белка в растворе (заряда и гидратной оболочки). Однако при избытке хлористоводородной и серной кислот выпавший осадок денатурированного белка снова растворяется. По-видимому, это происходит в результате перезарядки молекул белка и частичного их гидролиза. При добавлении избытка азотной кислоты растворения осадка не происходит. Вот почему для определения малых количеств белка в моче при клинических исследованиях применяется азотная кислота.

Осаждение органическими кислотами. Трихлоруксусная кислота осаждает только белки, а сульфосалициловая осаждает не только белки, но и высокомолекулярные пептиды. Сульфосалициловой кислотой пользуются при определении белка в моче.

Осаждение белка солями тяжелых металлов. Белки при взаимодействии с солями свинца, меди, ртути, серебра и других тяжелых металлов денатурируются и выпадают в осадок, что обусловлено адсорбцией тяжелых металлов на поверхности белковой молекулы и образованием нерастворимого комплекса. Однако при избытке некоторых солей наблюдается растворение первоначально образовавшегося осадка. Это связано с накоплением ионов металла на поверхности денатурированного белка и появлением положительного заряда на белковой молекуле.

Источник

Биохимия

zadocs.ru > Химия > Документы

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ. МЕТОДЫ ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКОВ. ВЫСАЛИВАНИЕ И ДЕНАТУРАЦИЯ

Растворы белков способны к осаждению (коагуляции).

Различают 2 вида реакции осаждения:

1) обратимое осаждение. Белковая молекула в растворе удерживается двумя факторами: зарядом и гидратной оболочкой. При высаливании нарушается гидратная, или водная оболочка, белка. Суммарный заряд белковой молекулы, его структура и свойства при этом не изменяются. Обратимое осаждение вызывается действием нейтральных солей аммония, щелочных и щелочноземельных металлов (высаливание), спирта, ацетона, эфира и некоторых других органических растворителей. Осажденные таким образом белки могут быть вновь растворены, например, если соли удалить методом диализа.

2) необратимое осаждение – денатурация. При этом нарушается гидратная оболочка белковой молекулы и изменяется ее суммарный заряд. Для большинства белков изоэлектрическая точка соответствует слабокислой среде (рН около 5,0). Снятие заряда осуществляется путем подведения рН к изоэлектрической точке. Удаление гидратной оболочки производится водоотнимающими средствами (органические растворители, соли щелочноземельных металлов в высокой концентрации), изменением температуры и др.
Лабораторная работа №2

^ ДИАЛИЗ РАСТВОРОВ БЕЛКОВ
ПРИНЦИП РАБОТЫ:

С помощью диализа очищают высокомолекулярные растворы белковых веществ от примеси низкомолекулярных соединений (солей, сахаров и др.).

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) раствор яичного белка с хлористым натрием; 2) AgNO₃, 0,5 % (в склянке из темного стекла); 3) HNO₃, 10 %; 4) NaOH, 10 %; 5) CuSO₄, 1 %; 6) кусочки целлофана размером 12,5х12,5 см; 7) дистиллированная вода; 8) стакан, стеклянные палочки.

В мешочек из целлофана наливают до половины раствор яичного белка (с хлористым натрием). Мешочек подвешивают на стеклянной палочке и погружают в стакан с дистиллированной водой. Диализ проводят при комнатной температуре. Через 40-60 минут из стакана берут в две пробирки по 2 мл воды. В одной пробирке проводят реакцию на ионы хлора, для чего воду подкисляют несколькими каплями 10 % раствора азотной кислоты и добавляют 2-3 капли раствора азотнокислого серебра, выпадает осадок хлористого серебра. С пробой во второй пробирке производят биуретовую реакцию. Если диализ проводится правильно, биуретовая реакция будет отрицательной.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОД:
Лабораторная работа №3

^ ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ ВЫСАЛИВАНИЕМ
ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Высаливание – это обратимый процесс. Нейтральные соли аммония, щелочных и щелочноземельных металлов – Na₂SO₄, (NH₄)₂SO₄, NaCl, MgSO₄ и другие нейтрализуют заряд белковых частиц и вызывают их дегидратацию, что ведет к выпадению в осадок. Осадки можно снова растворить в воде, при этом наблюдается значительная степень восстановления свойств белков (например, ферментативной активности, антигенных свойств и т.д.). Высаливанием пользуются для разделения белковых фракций, очистки белков, получения их в кристаллическом виде.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) раствор яичного белка с хлористым натрием; 2) NaCl, кристаллический, тонко растертый порошок (в виде пудры); 3) (NH₄)₂SO₄, кристаллический, тонко растертый порошок; 4) (NH₄)₂SO₄, насыщенный раствор; 5) MgSO₄, кристаллический, тонко растертый порошок; 6) СН₃СООН, 1 %; 7) NaOH, 10 %; 8) CuSO₄, 1 %; 9) пробирки, бумажные фильтры.

1. Осаждение сернокислым аммонием. В пробирку наливают 2-3 мл раствора белка, добавляют равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония и перемешивают. Выпадает осадок глобулинов, альбумины остаются в растворе. Осадок отфильтровывают через бумажный фильтр.

К фильтрату добавляют тонко растертый порошок сернокислого аммония до получения насыщенного раствора (последняя порция соли уже не растворяется). Выпадает осадок альбуминов, который также отфильтровывают.

С фильтратом проделывают биуретовую реакцию. При полном осаждении белков она должна быть отрицательной.

2. Осаждение сернокислым магнием или хлористым натрием. В 2 пробирки наливают по 2-3 мл раствора яичного белка и добавляют (до получения насыщенного раствора) в одну пробирку порошок хлористого натрия, в другую – сернокислого магния. Через 5-6 мин. в пробирках замечается выпадение осадков (глобулины). Альбумины в нейтральных растворах солей щелочных и щелочноземельных металлов не осаждаются.

Содержимое пробирок отфильтровывают через бумажные фильтры. В фильтратах – альбумины. Фильтраты подкисляют 1 % раствором уксусной кислоты – появляются осадки альбуминов. Их отфильтровывают, а в фильтратах с помощью биуретовой реакции доказывают отсутствие белка.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОД:
Лабораторная работа №4

^ ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ ПРИ КИПЯЧЕНИИ
ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Воздействие высокой температуры ведет к тепловой денатурации белков, в результате которой происходят необратимые изменения физико-химических и биологических свойств макромолекул.

На скорость и интенсивность процесса будут влиять рН и добавление электролитов. Быстро и наиболее полно белки денатурируют в изоэлектрической точке. Сдвиги рН в кислую и щелочную стороны затормаживают процесс осаждения белков. В сильно кислых и сильно щелочных растворах осаждения белков при кипячении практически не происходит. При добавлении кислот молекулы белка заряжаются положительно, в щелочных растворах они приобретают отрицательные заряды. Прибавление электролитов (например, хлористого натрия) ускоряет процесс осаждения даже в кислой среде.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) раствор яичного белка (без добавления хлористого натрия); 2) CH₃COOH, 1 %; 10 %; 3) NaOH, 10 %; 4) NaCl, насыщенный раствор; 5) пробирки; спиртовки; держатели.

В пять пробирок наливают по 5 капель раствора яичного белка.

1. В первой пробирке нейтральный раствор белка нагревают до кипе­ния. Жидкость мутнеет, поскольку разрушаются водные оболочки во­круг молекулы белка, и происходит укрупнение его частиц.

2. Во вторую пробирку добавляют 1 каплю 1 % раствора CH₃COOH и нагревают. Хлопьевидный осадок белка выпадает скорее и полнее, т.к. при подкислении рН раствора приблизится к изоэлектрической точке белка.

3. В третью пробирку добавляют 0,5 мл 10 % раствора CH₃COOH и нагревают. Даже при кипячении осадка не образуется, поскольку белковые мицеллы перезаряжаются и несут положительный заряд, что повышает их устойчивость.

4. В четвертую пробирку приливают 5 капель 10 % CH₃COOH и 2 капли насыщенного раствора NaCl и нагревают. Выпадает белый хлопьевидный осадок, т.к. частицы белка теряют заряд вследствие взаимодействия белка с разноименно заряженными ионами хлористо­го натрия, а так же теряют гидратную оболочку.

5. В пятую пробирку добавляют 2 капли 10 % раствора NaOH, создавая щелочную среду. При кипячении жидкости осадка не образуется, по­скольку в щелочной среде отрицательный заряд на частицах белка увеличивается.

Таблица 3

ВЫВОД:
Лабораторная работа №5

^ ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ СОЛЯМИ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ
ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Осаждение белков солями тяжелых металлов (в отличие от высаливания) происходит при небольших концентрациях солей. Белки при взаимодействии с солями тяжелых металлов (свинца, меди, серебра, ртути и др.) адсорбируют их, образуя с ними солеобразные и комплексные соединения, растворимые в избытке этих солей (за исключением солей AgNO₃, HgCl₂), но нерастворимые в воде. Соли тяжелых металлов вызывают необратимое осаждение белков, т.е. денатурацию. Растворение осадка в избытке солей называется адсорбционной пептизацией. Данное явление происходит вследствие возникновения одноименного положительного заряда на частицах белка.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) раствор яичного белка; 2) CuSO₄, 5 %; 3) (CH₃COO)₂Pb, 5 %; 4) AgNO₃, 3 %; 5) FeCl₃, 5 %; 6) пробирки.

Затем прибавляют избыток указанных солей.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОД:

Лабораторная работа №6

КОНЦЕНТРИРОВАННЫМИ МИНЕРАЛЬНЫМИ КИСЛОТАМИ
ПРИНЦИП РАБОТЫ:

Концентрированные минеральные кислоты вызывают резкую дегидратацию белковых частиц и нейтрализацию их заряда, при этом происходит образование комплексных соединений. В результате происходит денатурация белка. Ортофосфорная кислота осадка не дает. В избытке всех минеральных кислот, за исключением азотной, выпавший в осадок белок растворяется.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) раствор яичного белка; 2) HNO₃, конц.; 3) H₂SO₄, конц.; 4) HCl, конц.; 5) пробирки.

В 3 пробирки наливают по 1 мл кислот: в 1-ую – серной; во 2-ую – азотной; в 3-ю – соляной. Пробирки наклоняют под углом 45 º и осторожно (из пипетки) наслаивают по стенке раствор белка (пробирку следует держать отверстием от себя!). На границе белка и кислоты появляется белое кольцо.

Пробирки осторожно встряхивают и добавляют в них избыток соответствующих кислот.

РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОД:
Лабораторная работа №7

^ ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ ОРГАНИЧЕСКИМИ ВЕЩЕСТВАМИ
ПРИНЦИП РАБОТЫ:

В органических растворителях (спирт, ацетон и др.) белки не растворяются и выпадают в осадок. В зависимости от природы белка для его осаждения требуются различные концентрации спирта. Спирт связывает воду, вызывая дегидратацию мицелл белка и неустойчивость их в растворе. При осаждении спиртом раствор белка должен быть нейтральным или слабокислым, но не щелочным. Реакция облегчается присутствием электролита хлористого натрия вследствие снятия заряда с частиц белка. Реакция осаждения белка спиртом или кратковременным действием спирта обратима при охлаждении. Если осадок быстро отделить от спирта, то белок может сохранить нативное состояние.

РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ:

1) сульфосалициловая кислота, 20 %; 2) трихлоруксусная кислота, 10 %; 3) этиловый спирт; 4) раствор яичного белка; 5) пробирки.

В 3 пробирки отбирают по 5 капель раствора яичного белка.

В 1-ую пробирку добавляют 2 капли раствора сульфосалициловой кислоты. Во 2-ую – 2 капли трихлоруксусной кислоты. В 3-ю приливают 15-20 капель этилового спирта (раствор мутнеет), затем добавить 1 каплю насыщенного раствора хлористого натрия.

РЕЗУЛЬТАТ и ВЫВОД:
^ КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:
Объясните факторы устойчивости коллоидного раствора белка.

От чего зависит заряд белка в водном растворе?

Что такое изоэлектрическая точка белка? Какой заряд будут иметь водные растворы белка с избыточным количеством свободных карбоксильных групп?

Какой заряд будут иметь водные растворы белка с избыточным количеством аминогрупп? В какой среде будет ИЭТ такого белка?

Чем обусловлены реакции осаждения белков? При каких температурных условиях возможно осаждение белков?

Что такое обратимое и необратимое осаждение белков?

Что такое денатурация белка? Дайте характеристику денатурирующим агентам?

Что происходит с белковой молекулой при высаливании?

Источник

РЕАКЦИИ НЕОБРАТИМОГО ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКОВ

Реакции обратимого осаждения белков

Реакции осаждения белков бывают обратимыми и необратимыми.

При обратимом осаждении макромолекулы белка в основном не подвергаются глубокой денатурации, а осадки могут быть снова растворены в первоначальном растворителе. Обратимое осаждение вызывается действием нейтральных солей аммония, щелочных и щелочно-земельных металлов (высаливание), спирта, ацетона, эфира и некоторых других органических растворителей.

Реактивы: раствор яичного белка с добавлением хлорида натрия (белок одного куриного яйца отделяют от желтка и растворяют в 230 см 3 дистиллированной воды, к которой прибавляют 100 см 3 насыщенного раствора хлорида натрия, раствор фильтруют через марлю, сложенную в 3-4 слоя, и хранят в холодильнике); насыщенный раствор сульфата аммония; сульфат аммония, растертый в порошок; 10 %-ый раствор гидроксида натрия; 1%-ый раствор сульфата меди.

Оборудование: пробирки; воронка для фильтрования; бумажные фильтры.

Задание 1. Осаждение белковсульфатом аммония.

1. Впробирку отмерьте 2-3 см 3 раствора яичного белка, добавьте равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и смесь перемешайте.

2.Выпадает осадок глобулинов, альбумины остаются в растворе. Осадок отфильтруйте на бумажном фильтре.

3.К фильтрату добавьте порошок сульфата аммония до получения насыщенного раствора (последняя порция не растворяется).

4.Выпадает осадок альбуминов, который также отфильтруйте.

5.Фильтр с осадком альбулинов промойте 5 см воды, собирая фильтрат в чистую пробирку.

6.Проделайте с фильтратом биуретовую реакцию. Произошло ли растворение альбулинов?

Задание 2. Осаждение белков спиртом.

Органические растворители вызывают осаждение белков вследствие разрушения гидратной оболочки макромолекул.

1.В пробирку налейте 1 см раствора яичного белка с добавлением хлорида натрия.

2.По каплям прилейте 4-6 см 3 спирта и сильно взболтайте. Через 5-8 мин. выпадает осадок белков.

Лабораторная работа №3

РЕАКЦИИ НЕОБРАТИМОГО ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКОВ

При необратимом осаждении происходит глубокая денатурация белка. Денатурированный белок не способен к восстановлению своих первоначальных физико-химических и биологических свойств. Необратимое осаждение вызывается высокой температурой, действием концентрированных минеральных и некоторых органических кислот, ионов тяжелых металлов, алкалоидных реагентов, детергентов, красителей.

Реактивы: водный раствор яичного белка (раствор готовят, как указано в лабораторной работе № 6, часть 1); концентрированные серная, соляная и азотная кислоты; 5 %-ый раствор ацетата свинца; 2,5 %-ый раствор нитрата серебра; 5 %-ый раствор сульфата меди.

Реакция находит применение для быстрого определения белка в биологических жидкостях, например, моче.

Данную работу необходимо выполнять в вытяжном шкафу, соблюдая особую ОСТОРОЖНОСТЬ!

2.Пробирки наклоните под углом 45 о и ОСТОРОЖНО (из пипетки) наслоите по стенке раствор белка. Пробирку держите отверстием от себя. На границе белка и кислоты появляется белое кольцо.

3.Пробирки осторожно встряхните. Осадки растворяются в серной и соляной кислотах, но не растворяются в азотной кислоте.

Задание 2. Осаждение белков солями тяжелых металлов.

Белки осаждаются солями меди, свинца, ртути, цинка, серебра и других тяжелых металлов. Свойство белков связывать ионы тяжелых металлов используется в медицине при оказании первой помощи пострадавшим от отравления солями меди, свинца, ртути.

1.В три пронумерованные пробирки налейте по 5-10 капель раствора белка.

2.В первую пробирку по каплям прибавьте раствор ацетата свинца. Образуется осадок. Добавьте еще несколько капель, осадок должен раствориться в избытке раствора соли.

3.Во вторую пробирку по каплям приливайте раствор нитрата серебра. Образовавшийся осадок в избытке соли не растворяется.

4.В третью пробирку прибавьте раствор сульфата меди до появления осадка. Убедитесь, что осадок растворяется в избытке соли.

Оформите результаты проведенных исследований в виде таблицы.

Лабораторная работа №4

ТЕПЛОВАЯ ДЕНАТУРАЦИЯ БЕЛКА

При нагревании белки денатурируют. На процесс денатурации оказывают сильное влияние рН раствора и добавление электролитов.

Реактивы: водный раствор яичного белка (раствор готовят, как указано в лабораторной работе № 6, часть 1); 1%-ый раствор уксусной кислоты; 10 %-ый раствор уксусной кислоты; 10 %-ый раствор гидроксида натрия; насыщенный раствор хлорида натрия.

Оборудование: пробирки, водяная баня или спиртовка.

1.В пять пронумерованных пробирок налейте по 10 капель раствора яичного белка.

2.Белок в первой пробирке нагрейте до кипения. Раствор мутнеет (разрушаются гидратные оболочки вокруг макромолекул), но осадок не образуется. Мицеллы, образованные макромолекулами, сохраняют одноименный заряд, что препятствует их осаждению.

3.К раствору белка во второй пробирке добавьте одну каплю 1 %-ого раствора уксусной кислоты и нагрейте до кипения. Осадок белка выпадает быстро. Заряд мицелл нейтрализован и белок близок к изоэлектрической точке.

4.К раствору белка в третьей пробирке прибавьте 1-2 капли 10 %-ого раствора уксусной кислоты и нагрейте до кипения. Осадок не образуется, так как мицеллы белка приобрели, присоединяя ионы водорода, положительный заряд, что препятствует их осаждению.

5.В четвертую пробирку добавьте 1-2 капли 10 %-ого раствора гидроксида натрия и нагрейте до кипения. Осадок не выпадает. Мицеллы за счет отщепления протонов от карбоксильных групп боковых цепей белка заряжены отрицательно.

6.В пятую пробирку прибавьте 1-2 капель насыщенного раствора хлорида натрия и нагрейте до кипения. Белок выпадает в осадок.

Оформите результаты исследования, заполнив таблицу и кратко записав механизм денатурирующего действия исследуемого фактора в виде вывода.

Источник

Основные способы разрушения тканей и клеток при биохимическом исследовании

Сущность методики продавливания клеток, смешанных с абразивными частицами, через пресс Хьюза. Принцип устройства гомогенизаторов. Клеточное разрушение с помощью ультразвука. Использование реакций осаждения белков в клинической лабораторной практике.

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Для разрушения клеток чаще всего применяют физические методы. Большинство животных клеток разрушается сравнительно легко, однако при разрушении растительных и бактериальных клеток зачастую приходится сталкиваться со значительными трудностями, связанными с наличием клеточных стенок. Физические методы разрушения клеток подразделяются в зависимости от того, происходит ли оно под действием сил трения между клетками и твердыми веществами (растирание клеток с твердыми материалами) или гидродинамически (разрушение клеток в жидких средах).

1. Растирание клеток с твердыми материалами

В современной модификации этот метод состоит в растирании клеток с песком или абразивным порошком в ступке при помощи пестика. В настоящее время благодаря появлению более мягких способов разрушения этот метод применяется для разрушения животных клеток довольно редко, однако им по-прежнему пользуются для разрушения растительных и бактериальных клеток. Желательно, чтобы абразивные частицы были как можно более острыми и имели такой же размер, что и разрушаемые клетки. Недостаток метода заключается в том, что при разрушении клеток может нарушаться структура наиболее крупных органелл, таких, например, как хлоропласты.

Клетки бактерий можно разрушать также и путем механического встряхивания суспензий частиц с абразивным порошком с частотой 300—3000 колебаний в минуту при помощи встряхивателя Микля, в который добавляются мелкие стеклянные бусинки диаметром от 50 до 500 мкм. Однако возникающая при встряхивании сильная вибрация часто вызывает разрушение клеточных органелл.

2. Разрушение клеток в жидких средах

Разрушение клеток, находящихся в суспензии, происходит либо при вращении лопастей или поршня (блендеры), либо при поступательном движении вверх и вниз поршня или шаров (гомогенизаторы). Блендеры, как правило, имеют режущие лопасти, вращающиеся с большой скоростью. Количество и конструкция этих лопастей бывают разными, но все они обычно заострены под прямым углом друг к другу, а форма их обеспечивает хорошее перемешивание содержимого сосуда. Суспензию клеток помещают в специальный стакан, который имеет по всей высоте раструбы и в поперечном сечении выглядит как клеверный лист. Для поддержания низкой температуры в процессе гомогенизации стакан помещают в лед. Благодаря особому расположению лопастей и конструкции стакана в ходе фракционирования возникают гидродинамические силы. Метод достаточно универсален и широко применяется для фракционирования клеток, однако следует иметь в виду, что при быстром вращении лопастей гомогенизаторов возникают некоторые нежелательные эффекты.

Эффективность гомогенизации в значительной степени зависит от наличия в измельчаемом материале сосудистой и соединительной ткани, для удаления которой ткань перед гомогенизацией пропускают через специальную мясорубку с отверстиями диаметром 0,88 мм8. Полиморфоядерные лейкоциты разрушаются более мягкими методами— при помощи пипетки. Эозинофилы разрушают путем быстрого пропускания под давлением через мелкорешетчатое сито. Разрушение клеток с помощью высокого давления. Этот метод применяется в основном для разрушения микробных клеток. Для этой цели пользуются специальными прессами, например френч-прессом (French Pressure), в котором создается давление до 10,4-107 Па.

Суспензию клеток загружают в камеру из нержавеющей стали при закрытом положении игольчатого клапана, посредством которого камера сообщается с внешней средой. Затем камеру переворачивают, открывают клапан и поршнем вытесняют из камеры воздух, после чего клапан снова закрывают, а камеру возвращают в исходное положение и устанавливают на неподвижном основании. С помощью гидравлического пресса создается требуемое давление на поршень; по достижении в камере определенного давления игольчатый клапан немного открывается, давление в камере несколько уменьшается, и в этот момент клетки лопаются. Вытекающую из выходного отверстия камеры клеточную массу собирают при открытом положении игольчатого клапана, поддерживая в камере постоянное давление. К сожалению, неизвестно, какие именно силы возникают в камере и как им противостоят клетки и клеточные компоненты.

3. Разрушение с помощью ультразвука

Клетки можно разрушить также с помощью высокочастотных ультразвуковых колебаний. Механизм такого разрушения окончательно не выяснен, однако установлено, что при обработке клеточных суспензий ультразвуком в среде создается высокочастотное изменение давления. Основным недостатком данного метода является то, что в процессе обработки ультразвуком выделяется значительное количество тепла. Чтобы избежать разогревания, сосуд с суспензией помещают в лед; конструкция сосуда такова, что жидкость непрерывно циркулирует и охлаждается у стенок. Некоторые сосуды помещают в холодильные камеры; однако далеко не всегда удается устранить местное нагревание.

К ним относятся: разрушение клеток методом осмотического шока, переваривание клеточных стенок ферментами, например лизоцимом, и сложными ферментными препаратами, выделенными из улиток и содержащими целлюлазу, хитиназу и липазу. Для разрушения клеток некоторых видов успешно применяют замораживание и оттаивание, автолиз и обработку органическими растворителями, такими, как этилацетат и толуол.

Как мы уже говорили, в большинстве случаев разрушение клеток сопровождается выделением тепла. Ввиду того, что при высоких температурах многие ферменты инактивируются, все процедуры по разрушению клеток и выделению клеточных органелл следует проводить при пониженных температурах. Для этого все работы проводят в холодных комнатах при температуре около 0°С или охлаждают клеточные суспензии с помощью льда. Следует отметить, что некоторые ферменты неустойчивы к холоду и при охлаждении также теряют свою активность.

При гомогенизации разного рода биологических тканей возникает множество частных проблем, которые разрешаются в основном путем проб и ошибок. Достаточную воспроизводимость результатов можно получить лишь при тщательном контроле за такими параметрами, как температура, продолжительность и скорость разрушения клеток, а также применяемое рабочее давление. Идеальным считается такой гомогенат, который легко поддается дальнейшему фракционированию.

5. Способы осаждения белков

клеточный абразивный гомогенизатор ультразвук

Белки в растворе и соответственно в организме сохраняются в нативном состоянии за счет факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и гидратная оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию молекул белков и выпадению их в осадок. Осаждение белков может быть обратимым и необратимым в зависимости от реактивов и условий реакции. В клинической лабораторной практике реакции осаждения используют для выделения альбуминовой и глобулиновой фракций белков плазмы крови, количественной характеристики их устойчивости в плазме, обнаружения белков в биологических жидкостях и освобождения от них с целью получения без белкового раствора.

Под действием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия (удаления) этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства. Одним из видов обратимого осаждения белков является высаливание.

Сущность реакции заключается в дегидратации молекул белка.

1) неразведенный яичный белок;

2) насыщенный раствор сульфата аммония;

5) дистиллированная вода;

6) сульфат аммония в порошке.

Необратимое осаждение белков.

Необратимое осаждение белков связано с глубокими нарушениями структуры белков (вторичной и третичной) и потерей ими нативных свойств. Такие изменения белков можно вызвать кипячением, действием концентрированных растворов минеральных и органических кислот, солями тяжелых металлов.

Осаждение при кипячении.

1) яичный белок, 1% раствор;

2) уксусная кислота, 1% и 10% растворы;

Ход определения. В 4 пронумерованные пробирки приливают по 10 капель раствора яичного белка. Затем 1-ю пробирку нагревают до кипячения, при этом раствор мутнеет, но т.к. частицы денатурированного белка несут заряд, они в осадок не выпадают. Это связано с тем, что яичный белок имеет кислые свойства (его изоэлектрическая точка 4,8) и в нейтральной среде заряжен отрицательно; во вторую пробирку добавляют 1 каплю 1% раствора уксусной кислоты и нагревают до кипячения. Белок выпадает в осадок, т.к. его раствор приближается к изоэлектрической точке и белок теряет заряд (один из факторов устойчивости белка в растворе); в 3-ю пробирку добавляют 1 каплю 10% раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения. Осадка не образуется, т.к. в сильнокислой среде частицы белка приобретают положительный заряд (сохраняется один из факторов устойчивости белка в растворе); в 4-ю пробирку наливают 1 каплю раствора NaOH, нагревают до кипения. Осадок не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд белка увеличивается.

Осаждение концентрированными минеральными кислотами.

Концентрированные кислоты (серная, хлористоводородная, азотная и др.) вызывают денатурацию белка за счет удаления факторов устойчивости белка в растворе (заряда и гидратной оболочки). Однако при избытке хлористоводородной и серной кислоты выпавший осадок денатурированного белка снова растворяется. По-видимому, это происходит в результате перезарядки молекул белка и частичного их гидролиза. При добавлении избытка азотной кислоты растворения осадка не происходит. Вот почему для определения малых количеств белка в моче при клинических исследованиях применяется азотная кислота.

1) яичный белок,1% раствор;

2) концентрированная серная кислота;

3) концентрированная хлористоводородная кислота;

4) концентрированная азотная кислота.

Ход определения. В три пробирки наливают по 5 капель концентрированной серной, хлористоводородной и азотной кислот. затем, наклонив пробирку под углом 45 градусов, осторожно по стенке наслаивают такой же объем яичного белка. На границе двух слоев появляется осадок белка в виде белого кольца. Осторожно встряхивают пробирки, наблюдают растворение белка в пробирках с серной и хлористоводородной кислотами, в пробирке с азотной кислотой растворения белка не происходит.

Осаждение органическими кислотами.

Трихлоруксусная кислота осаждает только белки, а сульфосалициловая осаждает не только белки, но и высокомолекулярные пептиды. Сульфосалициловой кислотой пользуются при определении белка в моче.

1) яичный белок, 1% раствор;

2) трихлоруксусная кислота, 10% раствор;

3) сульфосалициловая кислота, 10% раствор.

Осаждение белка солями тяжелых металлов.

Белки при взаимодействии с солями свинца, меди, ртути, серебра и других тяжелых металлов денатурируются и выпадают в осадок. Однако при избытке некоторых солей наблюдается растворение первоначально образовавшегося осадка. Это связано с накоплением ионов металла на поверхности денатурированного белка и появлением положительного заряда на белковой молекуле.

1) яичный белок, 1% раствор;

2) сульфат меди, 10% раствор;

3) ацетат свинца, 5% раствор;

4) нитрат серебра, 5% раствор.

Осаждение органическими растворителями.

Теперь уже вполне определенно известно, что большинство молекул ферментов имеют полярные группы, являющиеся внешними по отношению к молекуле. Добавление органических растворителей к водным растворам белков будет понижать диэлектрическую постоянную смеси, создавая среду, которая больше отличается от полярной поверхности молекул фермента. Как свидетельствует теория растворимости, это ведет к снижению растворимости белков. Однако, поскольку молекулы ферментов имеют внутренние гидрофобные аминокислотные остатки и поэтому относительно свободно могут свертываться, то альтернативно добавлению органических растворителей они принимают новую, неактивную форму с экспонированием в окружающую среду гидрофобных группировок. Повреждение таких молекул при изменении их формы и последующая денатурация тем больше, чем выше температура. Это приводит к необходимости использовать для фракционирования большинства ферментов с помощью органических осадителей низкие температуры (часто ниже 0° С).

Размещено на Allbest.ru

Подобные документы

Оценка сложившегося административно-территориального устройства России. Исследование белков. Классификация белков. Состав и строение. Химические и физические свойства. Химический синтез белков. Значение белков.

реферат [537,6 K], добавлен 13.04.2003

Электрохимические методы анализа веществ. Общие физико-химические свойства аминокислот и белков, их функции в клетках живых организмов. Использование методов полярографии и амперометрии в исследовании кинетики химических процессов в аминокислотах.

курсовая работа [2,5 M], добавлен 18.07.2014

Характеристика наночастиц серебра. Влияние их на жизнеспособность лимфоцитов человека по результатам МТТ-теста. Культуры клеток, используемые для изучения токсичности in vitro. Изучение цитотоксичности наноматериалов в культурах клеток млекопитающих.

курсовая работа [1,0 M], добавлен 04.05.2014

Понятие о звуке. Звуковые волны в воздухе. Движение частиц при ее распространении. Сущность кавитации и магнитострикции. Методы изучения звукохимических реакций. Использование инфра- и ультразвука в качестве способа интенсификации химических процессов.

реферат [258,2 K], добавлен 24.05.2015

Характеристика белков как высокомолекулярных соединений, их структура и образование, физико–химические свойства. Ферменты переваривания белков в пищеварительном тракте. Всасывание продуктов распада белков и использование аминокислот в тканях организма.

реферат [66,2 K], добавлен 22.06.2010

Источник