Что такое обратимое осаждение белков

Реакции необратимого осаждения белков

При необратимом осаждении происходит глубокая денатурация и агрегация белка. Денатурированный белок не способен к восстановлению своих первоначальных физико-химических и биологических свойств. Необратимое осаждение вызывается высокой температурой, действием концентрированных минеральных и некоторых органических кислот, ионов тяжелых металлов, алкалоидных реагентов, детергентов, красителей.

Реактивы: водный раствор яичного белка (раствор готовят, как указано в лабораторной работе №1; концентрированные серная, соляная и азотная кислоты; 5 %-й раствор ацетата свинца; 2,5 %-й раствор нитрата серебра; 5 %-й раствор сульфата меди.

Задание 1. Осаждение белков минеральными кислотами.

Реакция находит применение для быстрого определения белка в биологических жидкостях, например, моче.

Ход работы

Данную работу необходимо выполнять в вытяжном шкафу, соблюдая особую осторожность!

Задание 2. Осаждение белков солями тяжелых металлов.

Белки осаждаются солями меди, свинца, ртути, цинка, серебра и других тяжелых металлов. Свойство белков связывать ионы тяжелых металлов используется в медицине при оказании первой помощи пострадавшим от отравления солями меди, свинца, ртути.

Ход работы

Оформление результатов

Оформите результаты проведенных исследований в виде таблицы.

Источник

BioximiaForYou

Белки в растворе и соответственно в организме сохраняются в нативном (природном) состоянии за счет факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и гидратная (водная) оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию молекул и выпадению их в осадок. Осаждение белков может быть обратимым и необратимым в зависимости от состава реактивов и условий реакций. В клинической лабораторной практике реакции осаждения используют для выделения альбуминовой и глобулиновой фракций (групп) белков плазмы крови, количественной характеристики их устойчивости в плазме, обнаружения белков в биологических жидкостях и освобождения от них с целью получения безбелкового раствора.

Под действием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия (удаления) этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства. Одним из видов обратимого осаждения белков является высаливание.

Реакция №1 «Высаливание»

Принцип: насыщенным раствором сульфата аммония осаждается альбуминовая фракция белков, полунасыщенным раствором сульфата аммония – глобулиновая фракция.

Сущность реакции заключается в дегидратации (обезвоживании) молекул белка.

Реактивы: 1) неразбавленный яичный белок; 2) насыщенный раствор сульфата аммония; 3) гидроокись натрия, 10% раствор; 4) сульфат меди, 1% раствор; 5) сульфат аммония в порошке; 6) дистиллированная вода.

Ход определения: в пробирку наливают 30 капель неразведенного яичного белка и добавляют равное количество насыщенного раствора сульфата аммония. Содержимое пробирки перемешивают. Получают полунасыщенный раствор сульфата аммония, при этом глобулиновая фракция белка осаждается, а альбуминовая остается в растворе. Через 5 минут осадок отфильтровывают, на фильтре остается глобулиновая фракция, а в фильтрате – альбуминовая. Осадок с фильтрата снимают стеклянной палочкой и переносят в пробирку, куда добавляют несколько капель воды, пока не растворится осадок. Наличие в растворе белка можно доказать с помощью биуретовой реакции, которая будет положительной.

В пробирку с фильтратом добавляют порошок сульфата аммония до полного насыщения раствора, т.е. до тех пор, пока не прекратится растворение соли. При этом выпадает осадок – альбумины. Его отфильтровывают, осадок с фильтра снимают стеклянной палочкой, растворяют водой и проводят биуретовую реакцию.

Необратимое осаждение белков связано с глубокими нарушениями структуры белков (вторичной и третичной) и потерей ими своих нативных свойств, т.е. денатурацией. Такие изменения белков можно вызывать кипячением, действием концентрированных растворов минеральных и органических кислот, солями тяжелых металлов и т.д.

Реакция №2 «Осаждение при кипячении»

Принцип: белки являются термолабильными соединениями и при нагревании свыше 50-60 0 С денатурируются. Сущность тепловой денатурации заключается в разрушении гидратной оболочки, разрыве стабилизирующих белковую молекулу связей и развертывании белковой молекулы. Наиболее полное и быстрое осаждение происходит в изоэлектрической точке (когда заряд молекулы равен нулю), поскольку при этом частицы белка наименее устойчивы. Белки, обладающие кислыми свойствами, осаждаются в слабокислой среде, а белки с основными свойствами – в слабощелочной. В сильнокислых или сильнощелочных растворах денатурированный при нагревании белок в осадок не выпадает, т.к. его частицы перезаряжаются и несут в первом случае положительный, а во втором – отрицательный заряд, что повышает их устойчивость в растворе.

Реактивы: 1) яичный белок, 1% раствор; 2) уксусная кислота, 1% и 10% растворы; 3) гидроокись натрия, 10% раствор.

Ход определения: в 4 пронумерованные пробирки приливают по 10 капель раствора яичного белка. Затем 1-ю пробирку нагревают до кипения, при этом раствор белка мутнеет, но так как частицы денатурированного белка несут заряд, они в осадок не выпадают. Это связано с тем, что яичный белок имеет кислые свойства (изоэлектрическая точка его рН 4,8) и в нейтральной среде заряжен отрицательно. Во 2-ю пробирку добавляют 1 каплю 1% раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения. Белок выпадает в осадок, так как его раствор приближается к изоэлектрической точке и белок теряет заряд (один из факторов устойчивости белка в растворе). В 3-ю пробирку добавляют 1 каплю 10% уксусной кислоты и нагревают до кипения. Осадка не образуется, так как в сильнокислой среде частицы белка приобретают положительный заряд (сохраняется один из факторов устойчивости белка в растворе). В 4-ю пробирку добавляют 1 каплю раствора гидроокиси натрия и нагревают до кипения. Осадок не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд частиц белка увеличивается.

Реакция №3 «Осаждение солями тяжелых металлов»

Принцип: белки при взаимодействии с солями свинца, меди, ртути, серебра и других тяжелых металлов денатурируются и выпадают в осадок. Однако при избытке некоторых солей наблюдается растворение первоначально образовавшегося осадка. Это связано с накоплением ионов металла на поверхности денатурированного белка и появлением положительного заряда на белковой молекуле.

Реактивы: 1) яичный белок, 1% раствор; 2) сульфат меди, 10% раствор; 3) ацетат свинца, 5% раствор, 4) нитрат серебра, 5% раствор.

Ход определения: в 3 пронумерованные пробирки вносят по 5 капель раствора яичного белка. В 1-ю пробирку добавляют 1 каплю сульфата меди. Во 2-ю пробирку добавляют 1 каплю ацетата свинца. В 3-ю пробирку добавляют 1 каплю нитрата серебра. Во всех пробирках выпадает осадок. Затем в первую пробирку добавляют 10 капель сульфата меди и во вторую пробирку добавляют 10 капель ацетата свинца и наблюдают растворение осадка. В третью пробирку вносят 10 капель нитрата серебра – растворение осадка нет.

Реакция №4 «Осаждение концентрированными минеральными кислотами»

Принцип: концентрированные кислоты (серная, хлористоводородная, азотная и др.) вызывают денатурацию белка за счет удаления факторов устойчивости белка в растворе (заряда и гидратной оболочки). Однако при избытке хлористоводородной и серной кислот выпавший осадок денатурированного белка вновь растворяется. По-видимому, это происходит в результате перезарядки молекул белка и частичного гидролиза. При добавлении избытка азотной кислоты растворение осадка не происходит (точный механизм этого явления не установлен). Вот почему для определения малых количеств белка в моче в клинических лабораториях пользуются азотной кислотой.

Реактивы: 1) яичный белок, 1% раствор; 2) концентрированная серная кислота; 3) концентрированная хлористоводородная кислота; 4) концентрированная азотная кислота.

Ход определения: в 3 пронумерованные пробирки наливают по 10 капель концентрированных кислот: в 1-ю пробирку серную кислоту, во 2-ю пробирку хлористоводородную, в 3-ю пробирку азотную. Затем, наклонив пробирку под углом 45 0 С, осторожно по стенке пробирки (так, чтобы жидкости не смешивались) наслаивают 1 каплю раствора яичного белка. На границе двух слоев появляется осадок белка в виде белого кольца. Осторожно встряхивают пробирки, и добавляют избыток кислот, после чего наблюдают растворение белка в пробирках с серной и хлористоводородной кислотами, а в пробирке с азотной кислотой растворения белка не происходит.

Реакция №5 «Осаждение органическими кислотами»

Принцип: трихлоруксусная кислота осаждает только белки, а сульфосалициловая осаждает не только белки, но и высокомолекулярные полипептиды. Сульфосалициловой кислотой (как самой чувствительной) широко пользуются для обнаружения белка в моче.

Реактивы: 1) яичный белок, 1% раствор; 2) трихлоруксусная кислота, 10% раствор; 3) сульфосалициловая кислота, 20% раствор.

Ход определения: в 2 пронумерованные пробирки приливают по 5 капель раствора яичного белка. Затем в 1-ю пробирку добавляют 2 капли сульфосалициловой кислоты, а во 2-ю пробирку добавляют 2 капли трихлоруксусной кислоты. В пробирках выпадает осадок белка.

Источник

Как удалить белки из раствора?

Денатурация

Денатурация – необратимое осаждение белка из-за разрыва связей, стабилизирующих четвертичную, третичную, вторичную структуры белка, сопровождаемое изменением растворимости, вязкости, химической активности, снижением или полной потерей биологической функции.

1. Физическая денатурация

Вызывается повышением температуры, ультрафиолетовым и микроволновым излучением, механическими воздействиями, ионизацией заряженными частицами.

2. Химическая денатурация

Зависит от природы денатурирующего реагента:

На эффекте химической денатурации основаны устаревшие, но простые и наглядные тимоловая проба и проба Вельтмана, используемые ранее в клиникo-лабораторной диагностике для оценки состава белков крови.

Высаливание

Соли в низких концентрациях способны взаимодействовать с ионными группами белков, отвечающих за внутримолекулярные взаимодействия, приводить к их раскрытию и повышать растворимость.

Так как белки плазмы крови отличаются по размерам, заряду, строению, то можно подобрать такие количества соли, которые вызовут осаждение менее устойчивых белков, пока другие еще будут растворены.

Например, раньше в диагностических целях так определяли соотношение белковых фракций альбумины/глобулины в плазме крови. Альбумины, как более полярные молекулы, остаются в растворенном состоянии при 50% насыщении раствора нейтральными солями, в то время как глобулины в этих условиях уже осаждаются. В норме соотношение альбумины/глобулины в плазме крови равно 1,2-1,8.

Осаждение водоотнимающими средствами

При добавлении водоотнимающих средств (ацетон, этанол) происходит отнятие у белка гидратной оболочки, но не заряда. Растворимость несколько снижается, но денатурации не наступает. Например, в этом заключается антисептическое действие этанола.

Изменение рН

Мягкое изменение рН до изоэлектрической точки белка ведет к исчезновению заряда, одновременному уменьшению гидратной оболочки и, как следствие, снижению растворимости молекулы.

Источник

Что такое обратимое осаждение белков

Реакции осаждения белков

4. Реакции осаждения белков

Белки в растворе и соответственно в организме сохраняются в нативном состоянии за счет факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и гидратная оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию молекул белков и выпадению их в осадок. Осаждение белков может быть обратимым и необратимым в зависимости от реактивов и условий реакции. В клинической лабораторной практике реакции осаждения используют для выделения альбуминовой и глобулиновой фракций белков плазмы крови, количественной характеристики их устойчивости в плазме, обнаружения белков в биологических жидкостях и освобождения от них с целью получения без белкового раствора.

Под действием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия (удаления) этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства. Одним из видов обратимого осаждения белков является высаливание.

1) неразведенный яичный белок;

2) насыщенный раствор сульфата аммония;

5) дистиллированная вода;

6) сульфат аммония в порошке.

Необратимое осаждение белков.

Необратимое осаждение белков связано с глубокими нарушениями структуры белков (вторичной и третичной) и потерей ими нативных свойств. Такие изменения белков можно вызвать кипячением, действием концентрированных растворов минеральных и органических кислот, солями тяжелых металлов.

Осаждение при кипячении.

1) яичный белок, 1% раствор;

2) уксусная кислота, 1% и 10% растворы;

Ход определения. В 4 пронумерованные пробирки приливают по 10 капель раствора яичного белка. Затем 1-ю пробирку нагревают до кипячения, при этом раствор мутнеет, но т.к. частицы денатурированного белка несут заряд, они в осадок не выпадают. Это связано с тем, что яичный белок имеет кислые свойства (его изоэлектрическая точка 4,8) и в нейтральной среде заряжен отрицательно; во вторую пробирку добавляют 1 каплю 1% раствора уксусной кислоты и нагревают до кипячения. Белок выпадает в осадок, т.к. его раствор приближается к изоэлектрической точке и белок теряет заряд (один из факторов устойчивости белка в растворе); в 3-ю пробирку добавляют 1 каплю 10% раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения. Осадка не образуется, т.к. в сильнокислой среде частицы белка приобретают положительный заряд (сохраняется один из факторов устойчивости белка в растворе); в 4-ю пробирку наливают 1 каплю раствора NaOH, нагревают до кипения. Осадок не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд белка увеличивается.

Осаждение концентрированными минеральными кислотами.

Концентрированные кислоты (серная, хлористоводородная, азотная и др.) вызывают денатурацию белка за счет удаления факторов устойчивости белка в растворе (заряда и гидратной оболочки). Однако при избытке хлористоводородной и серной кислоты выпавший осадок денатурированного белка снова растворяется. По-видимому, это происходит в результате перезарядки молекул белка и частичного их гидролиза. При добавлении избытка азотной кислоты растворения осадка не происходит. Вот почему для определения малых количеств белка в моче при клинических исследованиях применяется азотная кислота.

1) яичный белок,1% раствор;

2) концентрированная серная кислота;

3) концентрированная хлористоводородная кислота;

4) концентрированная азотная кислота.

Ход определения. В три пробирки наливают по 5 капель концентрированной серной, хлористоводородной и азотной кислот. затем, наклонив пробирку под углом 45 градусов, осторожно по стенке наслаивают такой же объем яичного белка. На границе двух слоев появляется осадок белка в виде белого кольца. Осторожно встряхивают пробирки, наблюдают растворение белка в пробирках с серной и хлористоводородной кислотами, в пробирке с азотной кислотой растворения белка не происходит.

Осаждение органическими кислотами.

Трихлоруксусная кислота осаждает только белки, а сульфосалициловая осаждает не только белки, но и высокомолекулярные пептиды. Сульфосалициловой кислотой пользуются при определении белка в моче.

1) яичный белок, 1% раствор;

2) трихлоруксусная кислота, 10% раствор;

3) сульфосалициловая кислота, 10% раствор.

Осаждение белка солями тяжелых металлов.

Белки при взаимодействии с солями свинца, меди, ртути, серебра и других тяжелых металлов денатурируются и выпадают в осадок. Однако при избытке некоторых солей наблюдается растворение первоначально образовавшегося осадка. Это связано с накоплением ионов металла на поверхности денатурированного белка и появлением положительного заряда на белковой молекуле.

1) яичный белок, 1% раствор;

2) сульфат меди, 10% раствор;

3) ацетат свинца, 5% раствор;

4) нитрат серебра, 5% раствор.

Источник

Осаждение белков

Белки в растворе и соответственно в организме сохраняются в нативном состоянии за счет факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и гидратная оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию молекул белков и выпадению их в осадок. Осаждение белков может быть обратимым и необратимым в зависимости от реактивов и условий реакции. В клинической лабораторной практике реакции осаждения используют для выделения альбуминовой и глобулиновой фракций белков плазмы крови, количественной характеристики их устойчивости в плазме, обнаружения белков в биологических жидкостях и освобождения от них с целью получения безбелкового раствора.

Обратимое осаждение.

Под действием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия (удаления) этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства.

Пример

В изоэлектрической точке белки обладают наименьшей способностью связывать воду, поэтому их легче осаждать. Агрегация белковых молекул происходит и при их обезвоживании с помощью некоторых органических растворителей – например спиртом и ацетоном. Молекулы этих веществ, являясь более гидрофильными, чем молекулы белка, образуют собственные гидраты с водой, оттягивая воду от белка, лишая их водной оболочки способствуют агрегации белка.

Обезвоживание белков можно проводить путем добавления нейтральных растворов солей высокой концентрации. Этот процесс называютвысаливанием. Осаждающая способность соли зависит от размеров катиона и аниона, а так же от величины их заряда. Высаливающее действие объясняется тем, что при высокой концентрации ионов в растворе белка, они оттягивают на себя от молекул белка поляризованные молекулы воды и тем самым лишают белок гидратной оболочки, которая препятствует осаждению белка. Метод высаливания используется для разделения и получения в очищенном виде белков и ферментов. Насыщенным раствором сульфата аммония осаждается альбуминовая фракция белков, полунасыщенным раствором – глобулиновая фракция.

При добавлении растворов нейтральных солей (Na₂SO₄, (NH₄)₂SO₄, MgSO₄ и др.) небольших концентраций, растворимость белков в воде возрастает. Растворению белков, как и других веществ, способствуют те факторы, которые уменьшают взаимодействие между молекулами растворяемого вещества. Нейтральные соли в малых концентрациях увеличивают степень диссоциации ионизированных групп белковых молекул и тем самым уменьшают белок-белковое взаимодействие. Известно, что степень диссоциации электролитов (в том числе белков) прямо пропорциональна диэлектрической постоянной растворителя, которая в свою очередь пропорциональна степени поляризации молекул растворителя, их дипольному моменту. Нейтральные соли в малых концентрациях еще больше увеличивают диэлектрическую постоянную воды. В результате вода усиливает диссоциацию растворенного вещества, в частности белка. Входя между заряженными группами и ориентируясь вокруг них, диполи воды препятствуют их взаимодействию.

Изоэлектрическое осаждение. Заряд белков обусловлен в первую очередь остатками аспаратата и глутамата (отрицательный заряд) и остатками лизина, аргинина и гистидина (положительный заряд). По мере повышения рН различными способами заряд белков проходит от положительных к отрицательным значениям и в изоэлектрической точке оказывается равен нулю. В результате белок лишается своей ионной атмосферы и его частицы слипаются, выпадая в осадок, что объясняется отсутствием электростатического отталкивания между молекулами белка и наименьшей способностью связывать воду. Различные белки осаждаются при различных условиях, таким образом их можно фракционировать.

Источник