Что такое осаждение белков
Осаждение белков
Белки в растворе и соответственно в организме сохраняются в нативном состоянии за счет факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и гидратная оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию молекул белков и выпадению их в осадок. Осаждение белков может быть обратимым и необратимым в зависимости от реактивов и условий реакции. В клинической лабораторной практике реакции осаждения используют для выделения альбуминовой и глобулиновой фракций белков плазмы крови, количественной характеристики их устойчивости в плазме, обнаружения белков в биологических жидкостях и освобождения от них с целью получения безбелкового раствора.
Обратимое осаждение.
Под действием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия (удаления) этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства.
Пример
В изоэлектрической точке белки обладают наименьшей способностью связывать воду, поэтому их легче осаждать. Агрегация белковых молекул происходит и при их обезвоживании с помощью некоторых органических растворителей – например спиртом и ацетоном. Молекулы этих веществ, являясь более гидрофильными, чем молекулы белка, образуют собственные гидраты с водой, оттягивая воду от белка, лишая их водной оболочки способствуют агрегации белка.
Обезвоживание белков можно проводить путем добавления нейтральных растворов солей высокой концентрации. Этот процесс называютвысаливанием. Осаждающая способность соли зависит от размеров катиона и аниона, а так же от величины их заряда. Высаливающее действие объясняется тем, что при высокой концентрации ионов в растворе белка, они оттягивают на себя от молекул белка поляризованные молекулы воды и тем самым лишают белок гидратной оболочки, которая препятствует осаждению белка. Метод высаливания используется для разделения и получения в очищенном виде белков и ферментов. Насыщенным раствором сульфата аммония осаждается альбуминовая фракция белков, полунасыщенным раствором – глобулиновая фракция.
При добавлении растворов нейтральных солей (Na2SO4, (NH4)2SO4, MgSO4 и др.) небольших концентраций, растворимость белков в воде возрастает. Растворению белков, как и других веществ, способствуют те факторы, которые уменьшают взаимодействие между молекулами растворяемого вещества. Нейтральные соли в малых концентрациях увеличивают степень диссоциации ионизированных групп белковых молекул и тем самым уменьшают белок-белковое взаимодействие. Известно, что степень диссоциации электролитов (в том числе белков) прямо пропорциональна диэлектрической постоянной растворителя, которая в свою очередь пропорциональна степени поляризации молекул растворителя, их дипольному моменту. Нейтральные соли в малых концентрациях еще больше увеличивают диэлектрическую постоянную воды. В результате вода усиливает диссоциацию растворенного вещества, в частности белка. Входя между заряженными группами и ориентируясь вокруг них, диполи воды препятствуют их взаимодействию.
Изоэлектрическое осаждение. Заряд белков обусловлен в первую очередь остатками аспаратата и глутамата (отрицательный заряд) и остатками лизина, аргинина и гистидина (положительный заряд). По мере повышения рН различными способами заряд белков проходит от положительных к отрицательным значениям и в изоэлектрической точке оказывается равен нулю. В результате белок лишается своей ионной атмосферы и его частицы слипаются, выпадая в осадок, что объясняется отсутствием электростатического отталкивания между молекулами белка и наименьшей способностью связывать воду. Различные белки осаждаются при различных условиях, таким образом их можно фракционировать.
ОСАЖДЕНИЕ НАТИВНЫХ БЕЛКОВ
СПОСОБЫ ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКОВ
Свойства воды гидратной оболочки
ФАКТОРЫ СТАБИЛИЗАЦИИ БЕЛКА В РАСТВОРЕ.
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ. РАСТВОРИМОСТЬ БЕЛКОВ В ВОДЕ.
а) Температура кипения выше 100 0 С.
б) Температура замерзания ниже 0 О С.
в) В воде гидратной оболочки не растворяются различные соли и другие гидрофильные вещества.
г) Окружая каждую молекулу белка, гидратная оболочка не дает этим белковым молекулам сблизиться, соединиться и выпасть в осадок.
Делятся на две группы:
1) Способы осаждения нативного белка
2) Способы осаждения денатурированного белка
Чтобы осадить белок из раствора, надо лишить его обоих факторов стабилизации: и заряда, и гидратной оболочки.
Наиболее типичным примером осаждения нативного белка является ВЫСАЛИВАНИЕ.
При высаливании сохраняется нативность белковых молекул. Если осадить белки с помощью высаливания, а затем уменьшить концентрацию солей, например, методом диализа, то белок опять растворится.
Осаждения белков без потери ими нативности можно достичь также с помощью водоотнимающих средств.
б) ПРИМЕНЕНИЕ ВОДООТНИМАЮЩИХ СРЕДСТВ. Такими средствами являются растворители, которые смешиваются с водой в любых соотношениях. Чаще всего это ацетон, этиловый спирт. Эти вещества отнимают гидратные оболочки белков, и белки выпадают в осадок, если они лишены заряда. Но, в отличие от высаливания, осадок сразу (немедленно!) должен быть отделен от растворителя. Если растворитель и белок будут длительно находиться в контакте, то могут произойти необратимые изменения структуры белковой молекулы (денатурация).
Как удалить белки из раствора?
Денатурация
Денатурация – необратимое осаждение белка из-за разрыва связей, стабилизирующих четвертичную, третичную, вторичную структуры белка, сопровождаемое изменением растворимости, вязкости, химической активности, снижением или полной потерей биологической функции.
1. Физическая денатурация
Вызывается повышением температуры, ультрафиолетовым и микроволновым излучением, механическими воздействиями, ионизацией заряженными частицами.
2. Химическая денатурация
Зависит от природы денатурирующего реагента:
На эффекте химической денатурации основаны устаревшие, но простые и наглядные тимоловая проба и проба Вельтмана, используемые ранее в клиникo-лабораторной диагностике для оценки состава белков крови.
Высаливание
Соли в низких концентрациях способны взаимодействовать с ионными группами белков, отвечающих за внутримолекулярные взаимодействия, приводить к их раскрытию и повышать растворимость.
Так как белки плазмы крови отличаются по размерам, заряду, строению, то можно подобрать такие количества соли, которые вызовут осаждение менее устойчивых белков, пока другие еще будут растворены.
Например, раньше в диагностических целях так определяли соотношение белковых фракций альбумины/глобулины в плазме крови. Альбумины, как более полярные молекулы, остаются в растворенном состоянии при 50% насыщении раствора нейтральными солями, в то время как глобулины в этих условиях уже осаждаются. В норме соотношение альбумины/глобулины в плазме крови равно 1,2-1,8.
Осаждение водоотнимающими средствами
При добавлении водоотнимающих средств (ацетон, этанол) происходит отнятие у белка гидратной оболочки, но не заряда. Растворимость несколько снижается, но денатурации не наступает. Например, в этом заключается антисептическое действие этанола.
Изменение рН
Мягкое изменение рН до изоэлектрической точки белка ведет к исчезновению заряда, одновременному уменьшению гидратной оболочки и, как следствие, снижению растворимости молекулы.
Осаждение белков широко используется в последующая обработка биологических продуктов с целью концентрирования белков и очищать их от различных загрязнений. Например, в биотехнология Промышленное осаждение белков используется для удаления загрязняющих веществ, обычно содержащихся в крови. [1] Основным механизмом выпадения осадков является изменение сольватационный потенциал растворителя, более конкретно, за счет снижения растворимость растворенного вещества путем добавления реагента.
Содержание
Общие принципы
В растворимость белков в водных буферах зависит от распределения гидрофильный и гидрофобный аминокислотные остатки на поверхности белка. Гидрофобные остатки преимущественно встречаются в ядре глобулярного белка, но некоторые существуют в виде пятен на поверхности. Белки с высокой гидрофобностью аминокислота содержимое на поверхности имеют низкую растворимость в водном растворителе. Заряженные и полярные поверхностные остатки взаимодействуют с ионными группами в растворителе и увеличивают растворимость белка. Знание аминокислотного состава белка поможет определить идеальный растворитель и методы для осаждения.
Отталкивающая электростатическая сила
Отталкивающие электростатические силы образуются, когда белки растворяются в электролит решение. Эти силы отталкивания между белками предотвращают агрегацию и способствуют растворению. При растворении в растворе электролита растворитель противоионы мигрируют к заряженным поверхностным остаткам на белке, образуя жесткую матрицу противоионов на поверхности белка. Рядом с этим слоем находится другой сольватационный слой, который менее жесткий и по мере удаления от поверхности белка содержит уменьшающуюся концентрацию противоионов и увеличивающуюся концентрацию коионов. Наличие этих сольватационных слоев приводит к тому, что белок имеет меньше ионных взаимодействий с другими белками и снижает вероятность агрегации. Отталкивающие электростатические силы также образуются, когда белки растворяются в воде. Вода образует сольватационный слой вокруг гидрофильных поверхностных остатков белка. Вода создает градиент концентрации вокруг белка с максимальной концентрацией на поверхности белка. Эта водная сеть демпфирует силы притяжения между белками.
Ионный сольватационный слой
Привлекательная электростатическая сила
Между белками существуют дисперсионные силы или силы притяжения через постоянные и индуцированные диполи. Например, основные остатки на белке могут иметь электростатические взаимодействия с кислотными остатками на другом белке. Однако сольватация ионами в растворе электролита или воде снижает силы притяжения белок-белок. Следовательно, для осаждения или индукции накопления белков необходимо уменьшить гидратный слой вокруг белка. Целью добавленных реагентов при осаждении белка является уменьшение гидратного слоя.
Образование осадка
Образование осадка белка происходит поэтапно. Сначала добавляется осаждающий агент, и раствор постоянно перемешивается. Смешивание вызывает столкновение осадителя и белка. Чтобы молекулы могли диффундировать через водовороты жидкости, требуется достаточно времени для перемешивания. Далее белки подвергаются зарождение фаза, в которой образуются белковые агрегаты или частицы субмикроскопических размеров. Рост этих частиц находится под контролем броуновской диффузии. Как только частицы достигают критического размера (от 0,1 мкм до 10 мкм для высоких и малых срезать поля соответственно), путем диффузионного присоединения к нему отдельных белковых молекул, они продолжают расти, сталкиваясь друг с другом и слипаясь или флокуляция. Эта фаза происходит медленнее. На заключительном этапе, называемом старением в поле сдвига, частицы осадка неоднократно сталкиваются и слипаются, а затем распадаются, пока не будет достигнут стабильный средний размер частиц, который зависит от отдельных белков. Механическая прочность белковых частиц коррелирует с произведением средней скорости сдвига и времени старения, которое известно как число Кэмпа. Старение помогает частицам противостоять сдвиговым силам жидкости, возникающим в насосах и зонах подачи центрифуг, без уменьшения размера.
Методы
Высаливание
Высаливание это наиболее распространенный метод, используемый для осаждения белка. Добавление нейтральной соли, такой как сульфат аммония, сжимает сольватационный слой и увеличивает межбелковые взаимодействия. Когда концентрация соли в растворе увеличивается, заряды на поверхности белка взаимодействуют с солью, а не с водой, тем самым обнажая гидрофобные пятна на поверхности белка и вызывая выпадение белка из раствора (агрегирование и осаждение).
Энергетика, занимающаяся высаливанием
Δграмм = Изменение свободной энергии, ΔЧАС = Изменение энтальпии при осаждении, ΔS = Изменение энтропии при осаждении, Т = Абсолютная температура. Когда молекулы воды в жестком сольватационном слое возвращаются в объемную фазу за счет взаимодействия с добавленной солью, их большая свобода движения вызывает значительное увеличение их энтропии. Таким образом, Δграмм становится отрицательным, и осадки происходят спонтанно.
Серия Хофмайстера
Космотропы или «стабилизаторы структуры воды» представляют собой соли, которые способствуют рассеянию / диспергированию воды из сольватационного слоя вокруг белка. Затем на поверхности белка экспонируются гидрофобные пятна, и они взаимодействуют с гидрофобными участками на других белках. Эти соли усиливают агрегацию и осаждение белков. Хаотропы или «разрушители структуры воды» имеют противоположный эффект Космотропов. Эти соли способствуют увеличению сольватационного слоя вокруг белка. Эффективность космотропных солей в преципитации белков соответствует порядку ряда Хофмайстера:
Высаливание на практике
Уменьшение растворимости белка следует за нормализованный кривая растворимости указанного типа. Связь между растворимостью белка и повышением ионной силы раствора может быть представлена как Кон уравнение:
Изоэлектрические осадки
Осаждение смешивающимися растворителями
Добавление смешивающийся растворители, такие как этиловый спирт или же метанол в раствор может вызвать осаждение белков в растворе. Сольватационный слой вокруг белка будет уменьшаться по мере того, как органический растворитель постепенно вытесняет воду с поверхности белка и связывает ее гидратными слоями вокруг молекул органического растворителя. С меньшими слоями гидратации белки могут агрегироваться за счет притягивающих электростатических и дипольных сил. Важными параметрами, которые следует учитывать, является температура, которая должна быть ниже 0 ° C, чтобы избежать денатурация, pH и концентрация белка в растворе. Смешиваемые органические растворители снижают диэлектрическая постоянная воды, что фактически позволяет двум белкам сблизиться. На изоэлектрическая точка соотношение между диэлектрической проницаемостью и растворимостью белка определяется выражением:
Неионные гидрофильные полимеры
Полимеры, Такие как декстраны и полиэтиленгликоли, часто используются для осаждения белков, поскольку они обладают низкой воспламеняемостью и с меньшей вероятностью денатурируют биоматериалы, чем изоэлектрическое осаждение. Эти полимеры в растворе притягивают молекулы воды от сольватационного слоя вокруг белка. Это увеличивает белок-белковые взаимодействия и усиливает преципитацию. Для конкретного случая полиэтиленгликоля осаждение можно смоделировать уравнением:
Флокуляция полиэлектролитами
Альгинат, карбоксиметилцеллюлоза, полиакриловая кислота, дубильная кислота и полифосфаты могут образовывать протяженные сети между молекулами белка в растворе. Эффективность этих полиэлектролитов зависит от pH раствора. Анионные полиэлектролиты используются при значениях pH ниже изоэлектрической точки. Катионные полиэлектролиты находятся при значениях pH выше pI. Важно отметить, что избыток полиэлектролитов заставит осадок снова раствориться в растворе. Примером полиэлектролитной флокуляции является удаление белкового облака из пивного сусла с помощью Ирландский мох.
Поливалентные ионы металлов
Реакторы осаждения
Существует множество реакторов промышленного масштаба, которые можно использовать для осаждения больших количеств белков, например рекомбинантных белков. ДНК-полимеразы из раствора.[1]
Реакторы периодического действия
Трубчатые реакторы
В трубчатых реакторах раствор исходного белка и осаждающий реагент контактируют в зоне эффективного смешивания, а затем подают в длинные трубки, где происходит осаждение. Жидкость в приближении элементов объема поршневой поток как они движутся по трубам реактора. Турбулентный поток создается за счет вставок в трубку из проволочной сетки. Трубчатый реактор не требует движущихся механических частей и стоит недорого. Однако реактор может стать непрактично длинным, если частицы собираются медленно.
Реакторы непрерывного действия с мешалкой (CSTR)
CSTR реакторы работают на устойчивое состояние с непрерывным потоком реагентов и продуктов в хорошо перемешанном резервуаре. Контакты для кормов со свежим белком суспензия который уже содержит частицы осадка и реагенты для осаждения.
Осаждение белков широко используется в последующая обработка биологических продуктов с целью концентрирования белков и очищать их от различных загрязнений. Например, в биотехнология Промышленное осаждение белков используется для удаления загрязняющих веществ, обычно содержащихся в крови. [1] Основным механизмом выпадения осадков является изменение сольватационный потенциал растворителя, более конкретно, за счет снижения растворимость растворенного вещества путем добавления реагента.
Содержание
Общие принципы
В растворимость белков в водных буферах зависит от распределения гидрофильный и гидрофобный аминокислотные остатки на поверхности белка. Гидрофобные остатки преимущественно встречаются в ядре глобулярного белка, но некоторые существуют в виде пятен на поверхности. Белки с высокой гидрофобностью аминокислота содержимое на поверхности имеют низкую растворимость в водном растворителе. Заряженные и полярные поверхностные остатки взаимодействуют с ионными группами в растворителе и увеличивают растворимость белка. Знание аминокислотного состава белка поможет определить идеальный растворитель и методы для осаждения.
Отталкивающая электростатическая сила
Отталкивающие электростатические силы образуются, когда белки растворяются в электролит решение. Эти силы отталкивания между белками предотвращают агрегацию и способствуют растворению. При растворении в растворе электролита растворитель противоионы мигрируют к заряженным поверхностным остаткам на белке, образуя жесткую матрицу противоионов на поверхности белка. Рядом с этим слоем находится другой сольватационный слой, который менее жесткий и по мере удаления от поверхности белка содержит уменьшающуюся концентрацию противоионов и увеличивающуюся концентрацию коионов. Наличие этих сольватационных слоев приводит к тому, что белок имеет меньше ионных взаимодействий с другими белками и снижает вероятность агрегации. Отталкивающие электростатические силы также образуются, когда белки растворяются в воде. Вода образует сольватационный слой вокруг гидрофильных поверхностных остатков белка. Вода создает градиент концентрации вокруг белка с максимальной концентрацией на поверхности белка. Эта водная сеть демпфирует силы притяжения между белками.
Ионный сольватационный слой
Привлекательная электростатическая сила
Между белками существуют дисперсионные силы или силы притяжения через постоянные и индуцированные диполи. Например, основные остатки на белке могут иметь электростатические взаимодействия с кислотными остатками на другом белке. Однако сольватация ионами в растворе электролита или воде снижает силы притяжения белок-белок. Следовательно, для осаждения или индукции накопления белков необходимо уменьшить гидратный слой вокруг белка. Целью добавленных реагентов при осаждении белка является уменьшение гидратного слоя.
Образование осадка
Образование осадка белка происходит поэтапно. Сначала добавляется осаждающий агент, и раствор постоянно перемешивается. Смешивание вызывает столкновение осадителя и белка. Чтобы молекулы могли диффундировать через водовороты жидкости, требуется достаточно времени для перемешивания. Далее белки подвергаются зарождение фаза, в которой образуются белковые агрегаты или частицы субмикроскопических размеров. Рост этих частиц находится под контролем броуновской диффузии. Как только частицы достигают критического размера (от 0,1 мкм до 10 мкм для высоких и малых срезать поля соответственно), путем диффузионного присоединения к нему отдельных белковых молекул, они продолжают расти, сталкиваясь друг с другом и слипаясь или флокуляция. Эта фаза происходит медленнее. На заключительном этапе, называемом старением в поле сдвига, частицы осадка неоднократно сталкиваются и слипаются, а затем распадаются, пока не будет достигнут стабильный средний размер частиц, который зависит от отдельных белков. Механическая прочность белковых частиц коррелирует с произведением средней скорости сдвига и времени старения, которое известно как число Кэмпа. Старение помогает частицам противостоять сдвиговым силам жидкости, возникающим в насосах и зонах подачи центрифуг, без уменьшения размера.
Методы
Высаливание
Высаливание это наиболее распространенный метод, используемый для осаждения белка. Добавление нейтральной соли, такой как сульфат аммония, сжимает сольватационный слой и увеличивает межбелковые взаимодействия. Когда концентрация соли в растворе увеличивается, заряды на поверхности белка взаимодействуют с солью, а не с водой, тем самым обнажая гидрофобные пятна на поверхности белка и вызывая выпадение белка из раствора (агрегирование и осаждение).
Энергетика, занимающаяся высаливанием
Δграмм = Изменение свободной энергии, ΔЧАС = Изменение энтальпии при осаждении, ΔS = Изменение энтропии при осаждении, Т = Абсолютная температура. Когда молекулы воды в жестком сольватационном слое возвращаются в объемную фазу за счет взаимодействия с добавленной солью, их большая свобода движения вызывает значительное увеличение их энтропии. Таким образом, Δграмм становится отрицательным, и осадки происходят спонтанно.
Серия Хофмайстера
Космотропы или «стабилизаторы структуры воды» представляют собой соли, которые способствуют рассеянию / диспергированию воды из сольватационного слоя вокруг белка. Затем на поверхности белка экспонируются гидрофобные пятна, и они взаимодействуют с гидрофобными участками на других белках. Эти соли усиливают агрегацию и осаждение белков. Хаотропы или «разрушители структуры воды» имеют противоположный эффект Космотропов. Эти соли способствуют увеличению сольватационного слоя вокруг белка. Эффективность космотропных солей в преципитации белков соответствует порядку ряда Хофмайстера:
Высаливание на практике
Уменьшение растворимости белка следует за нормализованный кривая растворимости указанного типа. Связь между растворимостью белка и повышением ионной силы раствора может быть представлена как Кон уравнение:
Изоэлектрические осадки
Осаждение смешивающимися растворителями
Добавление смешивающийся растворители, такие как этиловый спирт или же метанол в раствор может вызвать осаждение белков в растворе. Сольватационный слой вокруг белка будет уменьшаться по мере того, как органический растворитель постепенно вытесняет воду с поверхности белка и связывает ее гидратными слоями вокруг молекул органического растворителя. С меньшими слоями гидратации белки могут агрегироваться за счет притягивающих электростатических и дипольных сил. Важными параметрами, которые следует учитывать, является температура, которая должна быть ниже 0 ° C, чтобы избежать денатурация, pH и концентрация белка в растворе. Смешиваемые органические растворители снижают диэлектрическая постоянная воды, что фактически позволяет двум белкам сблизиться. На изоэлектрическая точка соотношение между диэлектрической проницаемостью и растворимостью белка определяется выражением:
Неионные гидрофильные полимеры
Полимеры, Такие как декстраны и полиэтиленгликоли, часто используются для осаждения белков, поскольку они обладают низкой воспламеняемостью и с меньшей вероятностью денатурируют биоматериалы, чем изоэлектрическое осаждение. Эти полимеры в растворе притягивают молекулы воды от сольватационного слоя вокруг белка. Это увеличивает белок-белковые взаимодействия и усиливает преципитацию. Для конкретного случая полиэтиленгликоля осаждение можно смоделировать уравнением:
Флокуляция полиэлектролитами
Альгинат, карбоксиметилцеллюлоза, полиакриловая кислота, дубильная кислота и полифосфаты могут образовывать протяженные сети между молекулами белка в растворе. Эффективность этих полиэлектролитов зависит от pH раствора. Анионные полиэлектролиты используются при значениях pH ниже изоэлектрической точки. Катионные полиэлектролиты находятся при значениях pH выше pI. Важно отметить, что избыток полиэлектролитов заставит осадок снова раствориться в растворе. Примером полиэлектролитной флокуляции является удаление белкового облака из пивного сусла с помощью Ирландский мох.
Поливалентные ионы металлов
Реакторы осаждения
Существует множество реакторов промышленного масштаба, которые можно использовать для осаждения больших количеств белков, например рекомбинантных белков. ДНК-полимеразы из раствора.[1]
Реакторы периодического действия
Трубчатые реакторы
В трубчатых реакторах раствор исходного белка и осаждающий реагент контактируют в зоне эффективного смешивания, а затем подают в длинные трубки, где происходит осаждение. Жидкость в приближении элементов объема поршневой поток как они движутся по трубам реактора. Турбулентный поток создается за счет вставок в трубку из проволочной сетки. Трубчатый реактор не требует движущихся механических частей и стоит недорого. Однако реактор может стать непрактично длинным, если частицы собираются медленно.
Реакторы непрерывного действия с мешалкой (CSTR)
CSTR реакторы работают на устойчивое состояние с непрерывным потоком реагентов и продуктов в хорошо перемешанном резервуаре. Контакты для кормов со свежим белком суспензия который уже содержит частицы осадка и реагенты для осаждения.