Что такое праймер биохимия
Праймер
Примечания
См. также
Полезное
Смотреть что такое «Праймер» в других словарях:
праймер — сущ., кол во синонимов: 1 • феромон (16) Словарь синонимов ASIS. В.Н. Тришин. 2013 … Словарь синонимов
ПРАЙМЕР — (англ. primer), феромон, действие которого проявляется не сразу, а через определенный и необходимый промежуток времени (например, “царское вещество” пчел). Экологический энциклопедический словарь. Кишинев: Главная редакция Молдавской советской… … Экологический словарь
праймер — Короткая последовательность молекулы ДНК, использующаяся для инициации синтеза специфического фрагмента при полимеразной цепной реакции [http://www.dunwoodypress.com/148/PDF/Biotech Eng Rus.pdf] Тематики биотехнологии EN primer … Справочник технического переводчика
Праймер — специальный дисперсионный лак, при помощи которого покрывают запечатанные слои обычных (традиционных) масляных офсетных красок, если предполагается нанести на слой этих красок слой УФ лака. П. служит буфером и разделяет слой краски от слоя лака,… … Реклама и полиграфия
праймер — poklijai statusas T sritis chemija apibrėžtis Suklijavimą gerinantis gruntas. atitikmenys: angl. primer rus. адгезионный грунт; праймер … Chemijos terminų aiškinamasis žodynas
праймер — pradmuo statusas T sritis chemija apibrėžtis Oligomeras, įeinantis į biopolimero sudėtį ir būtinas jo sintezei. atitikmenys: angl. primer rus. затравка; праймер … Chemijos terminų aiškinamasis žodynas
праймеріз — множинний іменник первинні вибори партійних кандидатів у США … Орфографічний словник української мови
Праймер произвольный — * праймер адвольны * arbitrary primer короткий олигонуклеотидный праймер, используемый в определенных ПЦР методах для инициации синтеза ДНК в случайных (произвольных) участках взятой для эксперимента ДНК мишени … Генетика. Энциклопедический словарь
Праймер затравка — Праймер, затравка * праймер, затраўка * primer короткий олигонуклеотид ДНК или РНК, комплементарный участку более длинной молекулы ДНК или РНК. К его 31 OH концу ДНК полимераза (см.) может добавлять нуклеотиды в растущую цепь ДНК в 51 31… … Генетика. Энциклопедический словарь
Праймер битумно-полимерный — ТЕХНОНИКОЛЬ № 03 (ТУ 5775 042 17925162 2006) – однокомпонентный материал холодного применения. Предназначен для обработки поверхности стальной ортотропной плиты и железобетонной плиты пролетных строений мостовых сооружений перед укладкой… … Энциклопедия терминов, определений и пояснений строительных материалов
Праймер (молекулярная биология)
Праймер — короткий фрагмент нуклеиновой кислоты или связана молекула, служит исходным пунктом репликации ДНК. Праймер нужен потому, что ни одна ДНК-полимераза (фермент, который катализирует репликацию ДНК) не может начать синтез новой молекулы ДНК с одноцепочечной матрице, поскольку нужна двухцепочечная участок для присоединения к ДНК, а также они способны только присоединять нуклеотид к уже имеющейся — ОН группы на 3 ‘конце другого нуклеотида.
Репликация ДНК
В естественной репликации ДНК, в качестве праймеров используются короткие цепочки РНК длиной около 12 нуклеотидов, синтезируются ферментомпраймазою. Праймазой может присоединять как рибонулеотиды, так и дезоксирибонуклеотидов, но синтезирует именно фрагмент РНК, поскольку рибонуклеотидов в ядре больше. Эти молекулы РНК позже изымаются и заменяются на ДНК ДНК-полимеразы.
Искусственные праймеры
Многие лабораторных методов биохимии и молекулярной биологии, привлекают использования ДНК-полимеразы, например секвенирования ДНК и полимеразная цепная реакция (ПЦР), требуют праймеров. Праймеры, используемые в этих методах, обычно короткие, химически синтезированные молекулы ДНК длиной 20-30 оснований.
Для ПЦР используют 2 праймеры, которые ограничивают с двух сторон последовательность, размножается. Для повышения специфичности реакции выбирают праймеры длиной 20-30 нуклеотидов, с содержанием Г-Ц пар около 50-60%. Г-Ц пары соединены между собой тремя водородными связями, поэтому они гарантируют лучший и более выборочный связь между праймером и матрицей. Для того, чтобы последовательность праймеров была уникальная и связывалась только с одной матрицей в смеси разных молекул ДНК (например, смесь всех ДНК человека), существуют специальные программы, которые с помощью баз последовательностей ДНК подбирают нужную последовательность нуклеотидов праймера.
Для клонирования последовательностей ДНК часто в последовательности праймеров вводят дополнительные нуклеотиды — сайты рестрикции, по которым режут ферменты рестриктазы. После приумножение нужного участка ДНК в ПЦР, полученные молекулы смешивают с ферментом, который разрезает их, образуя на концах так называемые «липкие концы». Такие конце позволяют легко вставить продукт ПЦР к искусственному ДНК-вектора.
СОДЕРЖАНИЕ
Механизм образования
Димер праймера образуется и амплифицируется в три этапа. На первом этапе два праймера отжигаются на их соответствующих 3′-концах (этап I на рисунке). Если эта конструкция достаточно стабильна, ДНК-полимераза будет связывать и удлинять праймеры в соответствии с комплементарной последовательностью (этап II на рисунке). Важным фактором, способствующим стабильности конструкции на этапе I, является высокое содержание GC на 3′-концах и длина перекрытия. Третий этап происходит в следующем цикле, когда одна нить продукта этапа II используется в качестве матрицы, к которой отжигаются свежие праймеры, что приводит к синтезу большего количества продукта PD.
Обнаружение
Димеры праймеров могут быть видны после гель-электрофореза продукта ПЦР. PD в гелях, окрашенных бромидом этидия, обычно видны как полоса из 30-50 пар оснований (п.о.) или мазок от умеренной до высокой интенсивности и отличимые от полосы последовательности-мишени, которая обычно длиннее 50 п.о.
Предотвращение образования димера праймера
Программное обеспечение для праймеров
ПЦР с горячим стартом
Воск : в этом методе фермент пространственно отделяется от реакционной смеси с помощью воска, который плавится, когда реакция достигает высокой температуры.
Медленное высвобождение магния : ДНК-полимеразе для активности требуются ионы магния, поэтому магний химически отделяется от реакции путем связывания с химическим соединением и выделяется в раствор только при высокой температуре.
Чувствительная к холоду полимераза Taq : это модифицированная ДНК-полимераза, практически не проявляющая активности при низкой температуре.
Структурные модификации праймеров
Другой подход к предотвращению или уменьшению образования частичных разрядов заключается в модификации праймеров таким образом, чтобы отжиг между собой или друг с другом не приводил к удлинению.
Блокированные-расщепляемые праймеры : метод, известный как РНКаза H-зависимая ПЦР (rhPCR), использует термостабильную РНКазу HII для удаления блокирующей группы из праймеров ПЦР при высокой температуре. Этот фермент РНКаза HII почти не проявляет активности при низкой температуре, поэтому удаление блока происходит только при высокой температуре. Фермент также обладает свойством распознавания несоответствия праймер: матрица, что приводит к дополнительной селекции против димеров праймеров.
Системы самоуправляемого молекулярного распознавания : также известные как SAMRS, устраняющие димеры праймеров путем введения аналогов нуклеотидов T *, A *, G * и C * в праймер. ДНК SAMRS могла связываться с природной ДНК, но не с другими членами того же вида SAMRS. Например, T * может связываться с A, но не с A *, а A * может связываться с T, но не с T *. Таким образом, благодаря тщательному проектированию праймеры, построенные из SAMRS, могут избежать взаимодействий праймер-праймер и обеспечить чувствительное обнаружение SNP, а также мультиплексную ПЦР.
Предотвращение получения сигнала от димеров праймеров
Четырехэтапная ПЦР : используется при работе с неспецифическими красителями, такими как SYBR Green I. Она основана на разной длине и, следовательно, разной температуре плавления PD и целевой последовательности. В этом методе сигнал получается ниже температуры плавления целевой последовательности, но выше температуры плавления PD.
Зонды, специфичные для последовательности : зонды TaqMan и молекулярные маяки генерируют сигнал только в присутствии своей целевой (комплементарной) последовательности, и эта повышенная специфичность препятствует получению сигнала (но не возможному ингибирующему воздействию на накопление продукта) от PD.
Полимеразная цепная реакция – руководство для начинающих
ПЦР — это метод современных лабораторий молекулярной биологии. Если вам нужно скопировать, упорядочить или количественно определить ДНК, вам необходимо знать ПЦР. Короче говоря, полимеразная цепная реакция — это биохимический метод, использующий термоциклирование и ферменты для быстрого и надежного копирования ДНК.
Эта статья дает краткий, базовый обзор ПЦР с несколькими советами, которые помогут вам избежать наиболее распространенных ошибок. Если вы новичок или имеете мало опыта в проведении ПЦР, то статья для вас. И даже если у вас есть опыт в ПЦР, стоит его немного освежить, и, возможно, получить один или два полезных совета.
Основные ингредиенты ПЦР:
Полимераза
Полимераза — это фермент, который при правильных условиях может собирать новые цепи ДНК из матричной ДНК и нуклеотидов. Первоначальная реакция ПЦР была громоздкой, потому что высокие температуры, необходимые для денатурации ДНК, разрушали полимеразу. Это означало, что после каждого цикла нагревания новые полимеразы необходимо было добавлять в реакцию вручную — дорогостоящее мероприятие. Эта проблема решена в современных методах, так как полимеразы, используемые в современной ПЦР, обычно происходят из одного из двух термофильных источников, бактерий Thermus aquaticus или Pyrococcus furiosus. Эти полимеразы, соответственно, Taq (произносится «липкость») и Pfu (произносится «PFU»), легко выдерживают высокие температуры. Коммерческие полимеразы Taq и Pfu спроектированы с учетом скорости, точности, способность завершать длительное чтение и читать шаблоны, богатые GC. Компании постоянно выпускают новые полимеразы. Поэтому не соглашайтесь на то, «что находится в вашем морозильнике», а ищите лучшую коммерческую полимеразу для ваших нужд. Также поговорите со своим местным торговым представителем, поскольку он часто может раздавать бесплатные образцы полимеразы, чтобы вы могли решить, что лучше для вас.
Шаблон ДНК
Это ДНК, для которой вы разрабатываете свои праймеры. Это ДНК, которую ваша полимераза будет читать и копировать. Ваша шаблонная ДНК может быть геномной, плазмидной или кДНК. Чем более целостная и чистая ваша матричная ДНК, тем легче получить хорошие результаты ПЦР. Также имейте в виду, что идеальное количество ДНК будет зависеть от вашего источника, обычно 1 пг — 1 нг плазмидной ДНК или 1 нг — 1 мкг геномной ДНК на реакцию ПЦР.
Праймеры
Праймеры — это короткие фрагменты синтезированной ДНК, которые связываются с вашей шаблонной ДНК. Вам нужно будет разработать один «прямой» праймер и один «обратный». Прямой праймер обозначает начало вашей ПЦР. Последовательность этого праймера такая же, как у вашей ДНК-матрицы 5´-3´. Обратный праймер обозначает конец вашей ПЦР. Последовательность этого праймера является обратно комплементарной ДНК вашего шаблона. Обычно праймеры имеют длину 18-22 пары оснований. Однако важнее, чем их длина, является температура плавления ваших: она должна быть 54-60 ° С и максимально совпадать для обоих праймеров. Существует множество онлайн-калькуляторов, которые могут рассчитывать температуры отжига праймеров, и большинство компаний, которые синтезируют праймеры, предоставляют такие калькуляторы.
Нуклеотиды
Как мономеры ДНК, нуклеотиды необходимы для создания копий. В большинстве экспериментов вы будете использовать дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP). Вы можете купить их отдельно или в виде смеси dGTP, dCTP, dATP и dTTP. Что бы вы ни покупали, имейте в виду, что нуклеотиды очень чувствительны к циклам замораживания и оттаивания. Поэтому лучше всегда создавать небольшие аликвоты ваших dNTP. Также убедитесь, что вы храните их правильно — не используйте морозильную камеру, которая проходит автоматические циклы размораживания.
Буфер
Большинство коммерческих полимераз поставляются с идеально подобранным буфером, который обеспечивает не только правильный рН, но и всегда содержит добавки, такие как магний, калий или ДМСО, которые помогают оптимизировать денатурирование, ренатурирование и полимеразную активность ДНК.
Термоциклирование
Вот где происходит волшебство. Все вышеперечисленные ингредиенты добавляют в пробирку для ПЦР, которую затем термоциклируют. При изобретении ПЦР отдельные пробирки вручную перемещали между водяными банями с подогревом. Теперь, благодаря изобретению термоциклеров (или амплификаторов), регулирование температуры осуществляется автоматически. Ниже приведен типичный алгоритм работы амплификатора ПЦР:
На этом этапе реакцию нагревают до 94-96°С в течение от 30 секунд до нескольких минут. Этот шаг обычно выполняется только один раз в самом начале реакции. Этот шаг важен для активации полимераз горячего старта, если вы используете такую полимеразу, и для денатурации вашей шаблонной ДНК.
На этом этапе смесь нагревают до 94-98°С в течение 15-30 секунд. Этот шаг денатурирует вашу ДНК и праймеры, что позволит им отжигать друг друга на следующем шаге.
На этом этапе температура вашей реакции быстро понижается до 50-64°C в течение 20-40 секунд. Температура на этом этапе должна быть достаточно низкой, чтобы ваши денатурированные праймеры могли образовывать пары оснований с вашей шаблонной ДНК. Но достаточно высокой, чтобы могли образовываться только самые стабильные (идеально спаренные) двухцепочечные структуры ДНК. Обычно эта идеальная температура отжига на несколько градусов ниже чем температура плавления вашей пары праймеров. Также на этом этапе ваша полимераза будет связываться с вашим комплексом ДНК праймер / матрица. Полимераза не начнет чтение, пока температура не повысится на следующем шаге.
На этом этапе реакционная смесь быстро нагревается до 72-80°C. В этот момент полимераза начинает чтение в направлении 5´-3´ и копировать ДНК шаблона в направлении 3´-5´. Более высокая температура на этом этапе уменьшает неспецифические взаимодействия ДНК праймера / матрицы, тем самым увеличивая специфичность реакции. Тем не менее, точная температура будет зависеть от предпочтения вашей полимеразы, поэтому перед экспериментом обязательно прочитайте инструкцию. Длина этого шага зависит от того, как долго будет длиться процесс копирования. Как правило, ДНК-полимераза может копировать 1000 пар оснований в минуту. Поэтому вам нужно выдержать смесь как минимум 1 минуту для копирования 1000 пар оснований. В конце инкубации будут созданы новые двухцепочечные фрагменты ДНК, состоящие как из матрицы, так и из новой ДНК.
Затем шаги 2-4 повторяют 15-40 раз
Чем больше циклов вы проведете, тем больше копий ДНК вы получите. Тем не менее, есть верхний предел. В какой-то момент доступные свободные нуклеотиды становятся ограничивающими, и преждевременно усеченные копии ДНК могут стать проблемой. Так что не жадничайте. Лучше получить меньше чистого продукта ПЦР, нежели большое количество сильно загрязненного.
Это необязательный, но часто рекомендуемый шаг. На этом этапе реакцию проводят при 70-74°С в течение нескольких минут. Обычно вы будете использовать ту же температуру, что и на шаге элонгации. Этот шаг позволяет полимеразам завершить считывание того участка, на котором они находятся в данный момент. Этот необязательный шаг может помочь уменьшить количество усеченных копий в конечном продукте.
Ваша реакция теперь завершена. Поскольку весь процесс может занять несколько часов, реакции ПЦР часто проводят в течение ночи. Рекомендуется запрограммировать ваш термоциклер на хранение продукта ПЦР при температуре 4°С до вашего возвращения. Советуем также прочесть статью о том, как провести ПЦР за 30 минут В это время вы можете проанализировать или использовать свой продукт, или перенести его в более подходящее долговременное хранилище, например, в холодильник.
Праймер для лица: что такое и как он работает
Если вы хотите, чтобы после уходовой бьюти-рутины тональное средство легло еще ровнее, советуем присмотреться к праймеру. Рассказываем, что это такое и как он работает.
Анастасия Игнатова
Тренер NARS в России
Что такое праймер?
Праймер – это средство для лица, которое нужно наносить для подготовки кожи к макияжу. Он является прекрасным дополнением к уходу за кожей.
Для чего он нужен?
Основная задача праймера – выравнивать поверхность кожи. Он необходим для создания идеального тона, так как на хорошо подготовленную кожу любое тональное средство ложится лучше. Также кроме праймера для лица популярен праймер для век, но об этом мы расскажем ниже.
Чем отличается праймер для сияния от праймера для выравнивания?
Праймер для сияния увлажняет и придает коже здоровый блеск. Например, база от NARS подходит для всех типов кожи и защищает от ультрафиолетовых лучей. Праймер для выравнивания работает как филер – заполняет морщины и сглаживает неоднородную поверхность кожи. Подходит коже с неоднородным рельефом, возрастной и очень сухой.
Заменит ли праймер с санскрином отдельный санскрин?
Да, только желательно, чтобы средство было с SPF 30 и выше. Праймер с высоким SPF-фактором может быть самостоятельным средством для защиты кожи от солнечных лучей.
Как сочетать праймер с SPF с тональным средством с SPF?
Можно использовать их вместе. Важно помнить, что SPF никогда не суммируется, работать будет средство с более высокой защитой.
Что такое разглаживающая база и как она работает?
Разглаживающая база мгновенного действия работает по принципу филера. Благодаря содержанию гиалуроновой кислоты и рисовой пудры, она мгновенно заполняет морщины и маскирует их. Такая база от бренда NARS сочетает все эти качества и идеально подходит для скрытия мелких мимических морщин.
Как работает праймер для век?
Стойкая база под макияж глаз содержит рисовую пудру, которая препятствует скатыванию теней. Она усиливает их цвет, и тени выглядят ярче и легче растушевываются. Праймеры для век с цветом могут использоваться как кремовые тени или в качестве подложки для усиления оттенка.