Что такое рекомбинантные белки и их значение

Рекомбинантный белок

Ген, кодирующий интересующий белок, вводится в геном видов-продуцентов (бактерии, клетки млекопитающих в культуре, трансгенные животные и т. Д.). Рекомбинантные белки можно очищать и использовать в терапевтических, промышленных или даже исследовательских целях.

Резюме

Исторический

Конструирование трансгена

Состав трансгена

Организм-донор экспрессирует интересующий белок. МРНК, кодирующая этот белок, изолирована от этого организма. МРНК позволяет синтезировать кДНК, которая будет использоваться для клонирования. Фактически, геномная ДНК эукариот не может использоваться в бактериальной системе, потому что у бактерий нет механизма для сплайсинга мРНК эукариот.

Вот почему метод RT-PCR часто используется для получения кДНК, кодирующей интересующий ген. После обратной транскрипции общих мРНК в оцДНК (одноцепочечные) с использованием праймеров poly dT, специфичных для поли A концов мРНК, кДНК, соответствующая мРНК, кодирующей интересующий белок, амплифицируется с помощью ПЦР с использованием специфических праймеров, к которым добавлены сайты рестрикции. который затем будет использован для клонирования.

После амплификации интересующей кДНК необходимо добавить последовательности, позволяющие нацеливаться на ткань транскрипции, а также сигналы для прекращения транскрипции и трансляции. Эти последовательности часто присутствуют в плазмиде, в которой клонирован интересующий ген:

Клонирование интересующего гена

Трансгенез и животные-основатели

Трансгенез

Выбор хоста

Это будет сделано в соответствии с желаемым использованием рекомбинантного белка, а также клеточными механизмами, необходимыми для производства функционального белка:

Введение интересующего гена в геном хозяина

Для бактерий и дрожжей трансген будет либо введен в клетку на плазмиде, либо интегрирован в бактериальный геном посредством двойной гомологичной рекомбинации.

В растениях интеграция рекомбинантной ДНК происходит с помощью «ДНК-пушки», которая проецирует микрошарики из золота или вольфрама, покрытых ДНК, или с помощью бактерий, способных переносить ДНК в свою клетку-хозяин (например, Agrobacterium tumefaciens ).

Пример трансгенеза на мышиной модели

Экзогенная ДНК вводится в мужской пронуклеус:

После производства белок очищается с использованием биохимических методов, таких как колоночная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография и т. Д.

Частые проблемы

Возможно, что количество копий интегрированного трансгена недостаточно, чтобы обеспечить производство интересующего белка в концентрации, удовлетворительной для его использования в больших масштабах.

Интеграция трансгена также может иметь вредные последствия для развития организма-хозяина:

Пример рекомбинантного антитромбина III

Во-первых, мы должны выбрать активный промотор в тканях или железах, в которых мы хотим восстановить рекомбинантный белок (в данном случае, козье молоко). Этот промотор необходимо клонировать. Чтобы белок присутствовал в молоке, введенная последовательность ДНК должна состоять из:

После завершения этого этапа трансгенез проводят, как описано выше. Наконец, белок очищается и затем продается (например, под названием ATryn).

Этот метод позволяет получить гораздо большее количество антитромбина, чем в крови человека.

Источник

Рекомбинантный белок: методы получения и применение

Белок является важным компонентом всех организмов. Каждая его молекула состоит из одной или нескольких полипептидных цепей, состоящих из аминокислот. Хотя информация, необходимая для жизни, кодируется ДНК или РНК, рекомбинантные белки выполняют широкий спектр биологических функций в организмах, включая ферментативный катализ, защиту, поддержку, движение и регуляцию. По своим функциям в организме эти вещества можно разделить на разные категории, такие как антитела, ферменты, структурный компонент. Учитывая важные функции такие соединения интенсивно изучались и широко применялись.

Вам будет интересно: Что такое в русском языке управление? Особенности и нормы управления в русском языке

В прошлом основным способом получения рекомбинантного белка было его выделение из природного источника, что, как правило, неэффективно и отнимает много времени. Недавние достижения в области биологических технологий молекул позволили клонировать ДНК, кодирующую определенный набор веществ, в вектор экспрессии веществ, таких как бактерии, дрожжи, клетки насекомых и клетки млекопитающих.

Проще говоря, рекомбинантные белки транслируются продуктами экзогенной ДНК в живых клетках. Их получение обычно содержит два основных этапа:

В настоящее время производство такой структуры является одним из самых мощных методов, используемых в медицине и биологии. Состав имеет широкое применение в исследованиях и биотехнологии.

Медицинское направление

Рекомбинантные белки обеспечивают важные методы лечения различных заболеваний, таких как диабет, рак, инфекционные заболевания, гемофилия и анемия. Обычные составы таких веществ включают антитела, гормоны, интерлейкины, ферменты и антикоагулянты. Существует растущая потребность в рекомбинантных составах для терапевтического применения. Они позволяют расширить методики лечения.

Вам будет интересно: Глаголы говорения в русском языке: общая характеристика, примеры

рекомбинантные белки, полученные с помощью генной инженерии, играют ключевую роль на рынке терапевтических лекарств. В настоящее время больше всего терапевтических веществ продуцируется в клетках млекопитающих, поскольку их составы способны производить высококачественные вещества, подобные природным. Кроме того, многие одобренные рекомбинантные терапевтические белки вырабатываются в кишечной палочке благодаря хорошей генетике, быстрому росту и высокопродуктивному производству. Это также несет положительный эффект при разработке лекарственных средств на основе этого вещества.

Проведение исследований

Получение рекомбинантных белков строится на разных методах. Вещества помогают выяснить основные и фундаментальные принципы организма. Эти молекулы могут быть использованы для идентификации и определения местоположения вещества, кодируемого конкретным геном, и для раскрытия функции других генов в различных клеточных активностях, таких как передача сигналов клетками, метаболизм, рост, репликация и гибель, транскрипция, трансляция и модификация рассматриваемых в статье составов.

Таким образом, обозреваемый состав часто используются в молекулярной биологии, клеточной биологии, биохимии, структурных и биофизических исследованиях и многих других областях науки. При этом получение рекомбинантных белков имеет международную практику.

Вам будет интересно: Дисклеймер – это попытка уйти от ответственности

Такие составы являются полезными инструментами в понимании межклеточных взаимодействий. Они доказали свою эффективность в нескольких лабораторных методах, таких как ИФА и иммуногистохимия (IHC). Рекомбинантные белки могут быть использованы для разработки ферментных анализов. При использовании в сочетании с парой соответствующих антител клетки могут применяться в качестве стандартов, для применения новых технологий.

Биотехнологии

Рекомбинантные белки, содержащие аминокислотную последовательность, также используются в промышленности, производстве продуктов питания, сельском хозяйстве и биоинженерии. Например, в животноводстве ферменты могут добавляться в пищу, чтобы повысить питательную ценность кормовых ингредиентов, снизить затраты и отходы, поддержать здоровье кишечника животных, улучшить производительность и улучшить окружающую среду.

Кроме того, молочнокислые бактерии (ЛАБ) долгое время использовались для производства ферментированных пищевых продуктов, и недавно ЛАБ была разработана для экспрессии рекомбинантных белков содержащих аминокислотную последовательность, которые могут найти широкое применение, например, для улучшения пищеварения человека, животных и питания.

Однако такие вещества также имеют ограничения:

В целом, достижения в области биотехнологии увеличили и способствовали производству рекомбинантных белков для различных применений. Хотя они все еще имеют некоторые недостатки, вещества важны в медицине, исследованиях и биотехнологии.

Связь с болезнями

рекомбинантный белок вред для человека не несет никакой. Это лишь составная часть общей молекулы при разработке конкретного препарата или элемента питания. Многие медицинские исследования показали, что принудительная экспрессия белка FGFBP3 (сокращенно BP3) в лабораторном штамме мышей с ожирением показала значительное снижение их жировой массы, несмотря на генетическую предрасположенность к употреблению.

Результаты таких опытов показывают, что белок FGFBP3 может предложить новую терапию для устранения нарушений, связанных с метаболическим синдромом, таких как диабет 2 типа и ожирение печени. Но поскольку BP3 является природным белком, а не искусственным лекарственным средством, клинические испытания рекомбинантного человеческого BP3 могут начаться после заключительного раунда доклинических исследований. На, то есть причины связанные с безопасностью проведения таких исследований. Рекомбинантный белок вред для человека не несет и по причине его ступенчатой обработки и очистки. Изменения происходят и на молекулярном уровне.

В экспериментах с проверкой концепции исследователи из Университета Алабамы в Бирмингеме под руководством доктора медицинских наук Х.Лонг Чжэна, профессора Роберта Б. Адамса и директора отдела лабораторной медицины на кафедре патологии в школе UAB Медицины, выдвинули на первый план потенциальную терапию редкого, но смертельного нарушения свертываемости крови, TTP.

Результаты этого исследования впервые демонстрируют, что переливание тромбоцитов, нагруженных rADAMTS13, может быть новым и потенциально эффективным терапевтическим подходом к тромбозу артерий, связанному с врожденным и иммуноопосредованным TTP.

Рекомбинантный белок — это не только питательное вещество, но и лекарственное средство в составе разрабатываемого препарата. Это лишь не многие направления, которые сейчас задействуются в медицине и относящиеся к исследованию всех его структурных элементов. Как показывает международная практика, структура вещества дает возможность на молекулярном уровне бороться со многими серьезными проблемами в организме человека.

Разработка вакцин

Рекомбинантный белок — это определенный набор молекул, которые можно моделировать. Подобное свойство используется и при разработке вакцин. Новая стратегия вакцинации, также известная как использование специальной рекомбинантной вирусной инъекции, может обеспечить защиту миллионов цыплят, которым угрожает серьезное респираторное заболевание, сообщили исследователи из Университета Эдинбурга и Института Пирбрайта. Эти вакцины используют безвредные или слабые версии вируса или бактерии для введения микробов в клетки организма. В этом случае эксперты использовали рекомбинантные вирусы с разными белками спайков в качестве вакцин для создания двух версий безвредного вируса. Существует много различных лекарственных препаратов построенных на это связи.

Рекомбинантный белок торговые названия и аналоги имеет следующие:

В основном это противоопухолевые препараты, но есть и другие направления в лечении, связанные с этим активным веществом.

Согласно новому исследованию, опубликованному в научном журнале Nature Communications, новая вакцина, также называемая LASSARAB, предназначенная для защиты людей как от лихорадки Ласса, так и от бешенства, показала многообещающие результаты в доклинических исследованиях. Кандидат на инактивированную рекомбинантную вакцину использует ослабленный вирус бешенства.

Исследовательская группа вставила генетический материал вируса Ласса в вектор вируса бешенства, чтобы вакцина экспрессировала поверхностные белки как у Ласса, так и клеток бешенства. Эти поверхностные составы вызывают иммунный ответ против возбудителей инфекций. Затем такая вакцина была инактивирована для «уничтожения» живого вируса бешенства, использованного для изготовления носителя.

Методы получения

Есть несколько систем производства вещества. Общий метод получения рекомбинантного белка строится на получении из синтеза биологического материала. Но есть и другие способы.

В настоящее время существует пять основных систем экспрессии:

Последний вариант особенно подходит для экспрессии трансмембранных белков и токсичных составов. В последние годы вещества, которые трудно экспрессировать обычными внутриклеточными способами, успешно интегрируются в клетках in vitro. В Беларуси получение рекомбинантных белков получило широкое применение. Есть ряд государственных предприятий, занимающихся этим вопросом.

Бесклеточная технология может легко и контролируемо добавлять разнообразные не встречающиеся в природе аминокислоты для достижения сложных процессов модификации, которые трудно решить после обычной рекомбинантной экспрессии. Подобные методы имеют высокую ценность для применения и потенциал для доставки лекарств и разработки вакцин с использованием вирусоподобных частиц. Большое количество мембранных белков было успешно экспрессировано в свободных клетках.

Экспрессия составов

Рекомбинантный белок CFP10-ESAT 6 вырабатывается и применяется для создания вакцин. Такой туберкулезный аллерген позволяет усилить иммунитет и выработать антитела. В общем, молекулярные исследования включают изучение любого аспекта белка, такого как структура, функция, модификации, локализация или взаимодействия. Чтобы исследовать, как конкретные вещества регулируют внутренние процессы, исследователям обычно требуются средства для производства функциональных соединений, представляющих интерес и пользу.

Учитывая размер и сложность белков, химический синтез не является жизнеспособным вариантом для этого начинания. Вместо этого, живые клетки и их клеточные механизмы обычно используются как фабрики для создания и конструирования веществ на основе предоставленных генетических шаблонов. Система экспрессии рекомбинантных белков в дальнейшем вырабатывает необходимую структуру для создания лекарства. Далее происходит отбор необходимого материала для разной категории препаратов.

В отличие от белков, ДНК легко конструировать синтетически или in vitro, используя хорошо зарекомендовавшие себя методы рекомбинантной. Следовательно, ДНК-матрицы специфических генов, с добавленными репортерными последовательностями или последовательностями аффинных меток или без них, могут быть сконструированы в качестве матриц для экспрессии обозреваемого вещества. Такие составы, полученные из таких ДНК-матриц, и называются рекомбинантными белками.

Традиционные стратегии экспрессии вещества включают трансфекцию клеток с помощью ДНК-вектора, который содержит матрицу, и последующее культивирование клеток с тем, чтобы они транскрибировали и транслировали желаемый белок. Обычно клетки затем лизируют для экстракции экспрессированного состава для последующей очистки. Белок рекомбинантный CFP10-ESAT6 обрабатывается таким образом и проходит систему очистки от возможного образования токсинов. Только после этого он поступает для синтезирования в вакцину.

Как прокариотические, так и эукариотические in vivo системы экспрессии молекулярных веществ широко используются. Выбор системы зависит от типа белка, требований к функциональной активности и желаемого выхода. Эти системы экспрессии включают млекопитающих, насекомых, дрожжей, бактерий, водорослей и клеток. У каждой системы есть свои преимущества и проблемы, и выбор правильной системы для конкретного применения важен для успешной экспрессии обозреваемого в статье вещества.

Экспрессия из млекопитающих

Вам будет интересно: Расстояние от Краснодара до Сочи. Особенности поездки по маршруту

Применение рекомбинантных белков позволяет разрабатывать вакцины и лекарства разного уровня. Для этого может задействоваться этот метод получения вещества. Системы экспрессии млекопитающих могут быть использованы для продуцирования белков из животного мира, которые имеют наиболее нативную структуру и активность благодаря своей физиологически релевантной среде. Это приводит к высоким уровням посттрансляционной обработки и функциональной активности. Системы экспрессии млекопитающих могут использоваться для производства антител, сложных белков и соединений для использования в функциональных анализах на основе клеток. Тем не менее, эти преимущества в сочетании с более жесткими условиями культуры.

Системы экспрессии млекопитающих можно использовать для получения белков временно или через стабильные клеточные линии, где конструкция экспрессии интегрирована в геном хозяина. В то время как такие системы могут использоваться в нескольких экспериментах, временная продукция может генерировать большое количество вещества за одну-две недели. Биотехнология рекомбинантных белков такого типа пользуется высоким спросом.

Эти преходящие, высокопродуктивные системы экспрессии млекопитающих используют суспензионные культуры и могут давать выход грамм на литр. Кроме того, эти белки имеют больше нативного фолдинга и посттрансляционных модификаций, таких как гликозилирование, по сравнению с другими системами экспрессии.

Экспрессия из насекомого

Методы получения рекомбинантного белка не ограничиваются только млекопитающими. Есть и более продуктивные способы в плане стоимости производства, хоть и выхода вещества на 1 литр обрабатываемой жидкости значительно ниже.

Клетки насекомых можно использовать для экспрессии белка высокого уровня с модификациями, подобными системам млекопитающих. Существует несколько систем, которые можно использовать для получения рекомбинантного бакуловируса, который затем можно применять для извлечения, представляющего интерес вещества в клетках насекомых.

Экспрессии рекомбинантных белков могут быть легко расширены и адаптированы к суспензионной культуре высокой плотности для крупномасштабного получения соединения молекул. Они более функционально похожи на нативный состав вещества млекопитающих. Хотя выход может составлять до 500 мг / л, производство рекомбинантного бакуловируса может занимать много времени и условия культивирования более сложные, чем прокариотические системы. Однако в более южных и теплых странах подобный метод считается более эффективным.

Бактериальная экспрессия

Производство рекомбинантных белков может быть налажено и при помощи бактерий. Эта технология намного отличается от описанных выше. Системы экспрессии бактериального белка популярны, потому что бактерии легко культивируются, быстро растут и дают высокие выходы рекомбинантного состава. Тем не менее, мультидоменные эукариотические вещества, экспрессируемые в бактериях, часто являются нефункциональными, потому что клетки не оборудованы для выполнения необходимых посттрансляционных модификаций или молекулярного сворачивания.

Кроме того, многие белки становятся нерастворимыми в виде молекул включения, которые очень трудно восстановить без жестких денатураторов и последующих громоздких процедур рефолдинга молекулярного состава. Такой метод по большей части считается еще во многом экспериментальным.

Бесклеточная экспрессия

Рекомбинантный белок содержащий аминокислотную последовательность стафилокиназы получается несколько иным путем. Он входит в состав многих видов инъекций, от чего требуется несколько систем перед использованием.

Бесклеточная экспрессия белка представляет собой синтез вещества in vitro с использованием совместимых с трансляцией экстрактов целых клеток. В принципе, целые клеточные экстракты содержат все макромолекулы и компоненты, необходимые для транскрипции, трансляции и даже посттрансляционной модификации.

Эти компоненты включают РНК-полимеразу, регуляторные белковые факторы, формы транскрипции, рибосомы и тРНК. При добавлении кофакторов, нуклеотидов и специфической матрицы генов эти экстракты могут синтезировать представляющие интерес белки за несколько часов.

Хотя они не являются устойчивыми для крупномасштабного производства, бесклеточные системы или системы экспрессии белка in vitro (IVT) имеют ряд преимуществ по сравнению с традиционными системами in vivo.

Бесклеточная экспрессия позволяет быстро синтезировать рекомбинантные составы без задействования клеточной культуры. Бесклеточные системы позволяют метить белки модифицированными аминокислотами, а также экспрессировать составы, которые подвергаются быстрой протеолитической деградации внутриклеточными протеазами. Кроме того, с помощью бесклеточного метода проще одновременно экспрессировать много разных белков (например, тестировать мутации белка путем экспрессии в небольшом масштабе из множества различных матриц рекомбинантных ДНК). В этом репрезентативном эксперименте для экспрессии белка каспазы-3 человека использовали систему IVT.

Выводы и перспективы на будущее

Производство рекомбинантного белка теперь можно рассматривать как зрелую дисциплину. Это результат многочисленных постепенных улучшений в очистке и анализе. В настоящее время программы по открытию лекарств редко останавливаются из-за невозможности продуцировать целевой белок. Параллельные процессы для экспрессии, очистки и анализа нескольких рекомбинантных веществ в настоящее время хорошо известны во многих лабораториях по всему миру.

Белковые комплексы и растущий успех в создании солюбилизированных мембранных структур потребуют большего количества изменений, чтобы идти в ногу со спросом. Появление эффективных контрактных исследовательских организаций для более регулярного снабжения белками позволит перераспределить ресурсы науки для решения этих новых задач.

Дополнительно, параллельные рабочие процессы должны позволять создавать полные библиотеки обозреваемого вещества, чтобы обеспечить возможность идентификации новых целей и расширенного скрининга, наряду с традиционными проектами по обнаружению лекарств на основе малых молекул.

Источник

Рекомбинантные белки

Рекомбинантные белки получены с помощью генной инженерии, так же называемой сплайсингом генов или методом рекомбинантных ДНК. Путем помещения генов человека, животных или растений в генетический материал клеток бактерий, млекопитающих или дрожжей, эти микроорганизмы могут использоваться как продуценты белков для медицинских, научных и исследовательских целей.

Рекомбинантная молекула ДНК должна быть реплицирована много раз для получения материала для анализа и секвенирования. Производство множества идентичных копий молекулы ДНК называют клонированием. Клонирование проводится in vitro с помощью полимеразно-цепной реакции (ПЦР). Клонирование in vivo может проводиться у одноклеточных микробов (например, E. coli), одноклеточных эукариот (дрожжи) и в клетках культур тканей млекопитающих.

Рекомбинантные ДНК должны быть получены клеткой в форме, в которой она может быть реплицирована и экспрессирована. Это достигается путем помещения ДНК в вектор. Ряд вирусов (как в клетках бкатерий, так и в клетках млекопитающих) могут служить в качестве векторов.

Рекомбинантная ДНК также иногда называется «химерой» при соединении двух или более типов ДНК. Существует три различных метода получения рекомбинантной ДНК: 1. Трансформация. 2. Трансфекция фагов. 3. Трансформация в клетках дрожжей, растений и млекопитающих. В первом случае необходимо выбрать участок ДНК, который должен быть инсерцирован в вектор с помощью ДНК лигазы. Инсерт содержит селектируемый маркер, который обеспечивает идентификацию рекомбинантных молекул.

Значительные количества рекомбинантных белков производятся в клетках-хозяевах только при добавлении генов экспрессии. Экспрессия белков зависит от генов, окружающих интересующую ДНК, этот набор генов действует как сигнал, который запускает транскрипцию и трансляцию нужной ДНК в клетке. Эти сигналы включают промотор, сайт связывания рибосом и терминатор.

Рекомбинантная ДНК инсерцируется в экспрессионный вектор, который содержит промотор, сайт связывания рибосом и терминатор. Ген не должен содержать интронов человека, поскольку бактерии не распознают их и это может стать причиной преждевременной терминации, и синтез или сборка белка могут быть нарушены.

Белки содержат сайты связывания металлов, которые могут быть использованы для очистки рекомбинантных или природных белков. Шесть или более идентичных гистидиновых остатков действуют как сайт связывания металлов для очистки и экспрессии белков. Последовательность hexa-His называют His-концом, который может быть помещен на N-конец белка-мишени. His-конец содержит сайт расщепления для специфических протеаз. Рекомбинантные белки с His-концом очищены методом метало-хелат аффинной хроматографии на никелевых ионных колонках, рекомбинантные белки после элюированы из метал-хелатной колонки с помощью гистидина или имидазола. Затем очищенный белок с His-концом обрабатывают с помощью специфической протеазы для отщепления His-конца, или не обрабатывают, если His-конец не влияет на активный сайт белка.

Источник