Что такое секвенирование генома

Секвенирование генома

Весь геном человека состоит из более чем трех миллиардов этих нуклеотидов, которые расположены в строго определенной последовательности.

К сожалению, иногда бывает так, что некотоые нуклеотиды исчезают или наоборот удваиваются или заменяются один на другой. Во многих случаях это ведет к неправильному формированию организма. Это может проявляться в виде врожденных пороков или малых аномалий развития, задержке психического развития, аутизме или имеет другие проявления.

Cеквенирование – это тест для определения генетических повреждений (мутаций) в ДНК, которые являются причиной наследственных болезней, наследственных предрасположенностей или особенностией организма.

Полногеномное секвенирование дает максимально полный набор данных о структуре генетического материала и позволяет детально оценить все индивидуальные генетические вариации

Секвенатор нового поколения IlluminaNextSeq 500 применяемый для секвенирования может определять полную структуру генома человека. Каждый участок генома при этом прочитывается 30 раз для повышения точности полученных данных.

Что можно получить при полногеномном секвенировании?

Когда нужно делать секвенирование генома?

В результате полногеномного секвениования получается огромный объем данных который требует специальной обработки. Такая обработка включает несколько этапов:

Источник

Как секвенируют ДНК

Секвенирование ДНК в последние десятилетия превратилось из узкой области, которой занималось небольшое число ученых, в одну из самых стремительно развивающихся технологий. Рост производительности и падение стоимости даже опережают закон Мура, и, из-за большой конкуренции на рынке и огромного спроса, развитие и дальше будет идти высокими темпами. Кроме того, развитие секвенирования привело к такому же буму в биоинформатике и коренным образом изменило биологию, и, постепенно, также основательно меняет медицину.

По катом я подробнее рассказываю, как это делают.

Что такое ДНК
Для начала, чтобы понимать сам процесс, немного необходимой теории.
ДНК — это полимерная цепь, состоящая из мономеров четырех типов, называемых нуклеотидами, последовательность которых и кодирует информацию об организме. Иначе говоря, ДНК можно представить как текст, написанный четырехбуквенным алфавитом. ДНК — молекула, состоящая из двух цепочек, и, хотя, последовательность нуклеотидов у них разная, последовательность одной цепочки можно однозначно восстановить, если известна последовательность другой. Поэтому цепочки называют комплементарными. (англ. Complement – дополнение) Это свойство используется при копировании клетки, когда цепочки ДНК расплетаются, и, на каждой, как на матрице, синтезируется вторая, и каждая из двух дочерних клеток получает свою двуцепочечную ДНК. Вся последовательность ДНК организма называется геномом. Например, геном человека состоит из 46 хромосом.

Несмотря на большое количество разнообразных, как экспериментальных, так и устаревших методов, мейнстримовые коммерческие методы довольно похожи, и, чтобы не делать оговорки каждый раз, сразу скажу, что речь дальше будет идти именно об этих мейнстримовых методах.

Как это выглядит в общем
Перед описанием технологии секвенирования, для интуитивного понимания, проведу следующую аналогию: стопку одинаковых газет взрывают так, что они разлетаются на небольшие кусочки с отрывками текста, а, затем, каждый из этих кусочков читают и, из этих прочтений восстанавливают текст первоначальной газеты.

Чтобы секвенировать ДНК, сначала ее выделяют из исследуемого образца, затем режут на небольшие фрагменты случайным образом, фрагменты называются ридами. От каждого рида оставляют по одной цепочке, и на этой цепочке, как на матрице, синтезируют вторую, причем, тип каждого следующего присоединяющегося нуклеотида как-то детектируют. Таким образом, записывая последовательность присоединившихся нуклеотидов, восстанавливают их последовательность в каждом риде. Затем, из последовательностей ридов с помощью компьютерных программ реконструируют геном.

Важный момент. Суммарная длина ридов должна многократно превышать длину исследуемой ДНК. Делается это потому, что, когда ДНК выделяют из образца, и когда ее режут, часть ее теряется, так что никто не гарантирует, что каждый ее участок попадет хотя бы в один рид. Поэтому, чтобы каждый участок гарантированно был бы прочтен, ДНК берут с большим запасом. Кроме того, при секвенировании возможны ошибки, и, чтобы более надежно прочитать ДНК, каждый ее участок следует прочитать несколько раз.

ДНК разрезают на риды, которые читают, и из них восстанавливают первоначальную последовательность

Такая методика используется не от хорошей жизни. Она добавляет множество трудностей, и, если бы исследователи могли взять и прочитать за раз целую последовательность генома, то они были бы счастливы, однако, это на данный момент невозможно.
У этого есть 2 причины. Первая — это ошибки, происходящие при чтении каждого нуклеотида. Они постепенно накапливаются, и, каждый следующий нуклеотид читается хуже предыдущего, и, в какой-то момент качество чтения настолько снижается, что дальше продолжать процесс бессмысленно. У разных методов секвенирования длина рида, которы они могут хорошо прочитать, составляет порядка десятков или сотен нуклеотидов. Вторая заключается в том, что ДНК — это очень длинная молекула, и, при скрупулезном чтении каждой буквы друг за дружкой, секвенирование заняло бы неприлично много времени, а в данном случае этот процесс легко распараллеливается, и можно одновременно читать миллионы и миллиарды ридов.

Illumina
Такая схема в общих чертах описывает все популярные методики секвенирования. Различаются они лишь методами детекции присоединившихся нуклеотидов при синтезе, и методикой подготовки материала.

На сегодняшний день самым распространенным является метод, который используется в секвенаторах компании Illumina. В этом методе сначала множество различных ридов прикрепляется к стеклянной пластине. Затем, с каждого рида делают множество копий на поверхности пластины так, чтобы на каждом ее небольшом участке располагались лишь одинаковые копии. Это делается для того, чтобы при последующем секвенировании получать сигнал не от одиночной молекулы, а от группы одинаковых молекул, располагающихся рядом. Так и сигнал легче считывать, и надежность считывания увеличивается. Эти молекулы являются одноцепочечными ДНК, и на них в процессе секвенирования синтезируются комплементарные цепи. Реакцию синтеза проводят следующим образом: К началу каждой молекулы присоединяется по одному нуклеотиду. Этот нуклеотид химически блокирован так, что после его присоединения синтез дальше не идет. Кроме того, к нему присоединена метка, которая под действием лазера люминесцирует. Причем, для каждого типа нуклеотидов цвет люминесценции разный. После присоединения нуклеотида пластину освещают лазером и фотокамера фиксирует цвета, которыми люминесцирует пластина. После этого блокировку снимают, метку также снимают, и присоединяют таким же образом следующий нуклеотид. Последовательность световых сигналов на каждом участке пластины в компьютере переводится в последовательность нуклеотидов, и, на выходе получается файл, содержащий последовательности ридов.

Секвенирование по методу Illumina
1 — геномная ДНК 2 — разрезается на риды 3 — к ридам прикрепляются адаптеры, с помощью которых они приклеиваются на 4 — пластину 5 — размножение ридов на пластине 6 — засовывам в секвенатор и 7 — секвенируем

Сборка и аннотирование генома
Если геномы близких организмов раньше не секвенировались, то из ридов, затем, с помощью программ, пытаются собрать единую последовательность нуклеотидов. Риды частично перекрываются, и, с помощью этих перекрытий пытаются выстроить единую последовательность. Здесь есть множество моментов, которые существенно осложняют дело. Например, можно загрязнить образец, и программа будет пытаться выстроить одну последовательность из ДНК разных организмов. Секвенатор может ошибиться при чтении рида, или неверно связать два места в геноме, потому что они очень похожи. На самом деле, сложностей так много, что всех тут не перечислишь. И, некоторые из них настолько сложно поддаются устранению, что, даже геном человека, самый важный и широко исследуемый геном, все еще не секвенирован до конца.

риды и внизу последовательность генома, которая реконструирована на их основе

Когда последовательность генома собрана, то нужно понять, что она значит. На ней находят участки, которые похожи на гены. Делается это следующим образом: В начале и конце генов находятся определенные «метки» из нуклеотидов, и, если на ДНК находят такие последовательности на таком растоянии, что между ними может уместиться ген, то такое место заносится в список потенциальных генов. Затем, этого претендента сравнивают с базой данных уже известных генов других организмов, и, если в ней находят ген, достаточно сильно похожий на этот участок, то ему присваивают функцию этого гена.

Если геном другого организма этого вида уже секвенировался, то его используют, для сборки. Так как геномы разных организмов одного вида различаются лишь незначительно, то для каждого рида находят место на секвенированном геноме, к которому он ближе всего, и на основе этого генома собирают новый.

Источник

Одноклеточное секвенирование: разделяй, изучай и властвуй

Одноклеточное секвенирование: разделяй, изучай и властвуй

Одноклеточное секвенирование дает возможность увидеть более детальную картинку. Рисунок в полном размере.

Автор

Редакторы

Современные методы полногеномного секвенирования позволяют считывать миллиарды последовательностей нуклеиновых кислот (НК) — ДНК или РНК — за считанные часы. Человечество вплотную подобралось к пониманию механизмов реализации генетического материала в живых системах, и новые технологии одноклеточного секвенирования с возможностью визуализации пространственного положения нуклеиновых кислот внутри или вне клетки, похоже, стали еще одним шагом к этой цели.

Ультрасовременные методы

Методы, которыми оперирует современная наука, постоянно совершенствуются. Некоторые области развиваются настолько стремительно, что порой даже специалистам сложно уследить за новейшими приборами и модификациями методик. Так происходит, например, в геномике. Другие же области (такие как гистология и связанные с ней световая и флуоресцентная микроскопия) развиваются куда медленнее, но всё равно расширяются и обзаводятся более высокопроизводительными методами. В статьях нового спецпроекта (он продолжает наш хит — «12 биологических методов в картинках») мы хотим рассказать, какие методы помогают ученым совершать новые открытия сегодня, и чего нам ждать в будущем.

Партнер этой статьи — «СкайДжин».
Пять причин выбрать SkyGen:

К середине прошлого столетия, в момент открытия нуклеиновых кислот (НК — ДНК и РНК) как носителей генетической информации живых организмов, перед исследователями встал вопрос о возможности прочтения их последовательности — секвенирования. Десятки лет и поступательный прогресс во многих отраслях науки и инженерии сделали возможным сначала определение последовательности отдельных фрагментов ДНК, а затем и секвенирование целых геномов.

К настоящему времени разработано и выведено на биотехнологический рынок значительное количество методов секвенирования НК. Самый популярный и надежный из них — секвенирование методом «терминаторов» — разработал британский биолог Фредерик Сэнгер с коллегами в далеком 1977 году [1]. За десятки лет данный метод неоднократно модифицировался (например, радиоактивные метки заменили флуоресцентными), однако идея, лежащая в его основе, не изменилась. Анализируемый, предварительно многократно амплифицированный фрагмент ДНК (до 1000 пар нуклеотидов (п.н.) — букв генетического алфавита) используется как матрица для синтеза комплементарной (дочерней) цепочки ферментом ДНК-полимеразой в присутствии дезоксинуклеозидтрифосфатов (А, Т, Г, Ц — аденина, тимина, гуанина и цитозина). Кроме того, в смеси находятся флуоресцентно меченные дидезоксинуклеозидтрифосфаты, которые прерывают реакцию синтеза из-за особенности химического строения. Благодаря флуоресценции и электрофорезу в геле можно точно установить длину конкретного секвенируемого фрагмента ДНК и последнюю букву в нем. Поскольку в реакционной смеси параллельно проходят тысячи реакций, используя этот уже полностью автоматизированный метод, можно восстановить последовательности десятков ДНК-фрагментов.

Несмотря на то, что определение последовательностей НК по Сэнгеру до сих пор является «золотым» стандартом секвенирования и нашло свое применение в различных жизненно важных отраслях (таких как медицинская генетика и криминалистика), его производительность оставляет желать лучшего [2], [3].

Геномы многих растений и позвоночных животных, в том числе и человека, состоят из миллиардов «букв», и определение их полных последовательностей с использованием настолько «олдскульных» методов экономически нецелесообразно.

За последние годы сразу несколько технологий глубокого секвенирования внедрились в современную биологическую науку. Некоторые из них — лигазное секвенирование или пиросеквенирование, о которых можно почитать в нашей обзорной статье «12 методов в картинках: секвенирование нуклеиновых кислот» [2], — уже не поддерживаются их разработчиками, в то время как секвенирование на молекулярных кластерах (также известное как технология Illumina), или одномолекулярное секвенирование в реальном времени (чуть позднее к ним присоединилась технология cPAS секвенирования), прочно заняли свои ниши. Одна часть этих технологий прекрасно подходит для анализа новых, ранее не опубликованных геномов или поиска длинных некодирующих РНК, тогда как другая эффективна и обходится дешевле при ресеквенировании или анализе экспрессии генов. Более того, исследователи могут комбинировать разнообразные методы для достижения наиболее интересных результатов. В частности, одномолекулярное секвенирование — которое осуществляется благодаря приборам PacBio, — также как и нанопоровое секвенирование (Oxford Nanopore) [2], [10], регулярно используется вместе с технологией Illumina для хромосомной сборки новых геномов, в том числе и полиплоидных [11–13].

Одноклеточное секвенирование (ОКС, scRNA-seq)

Таким образом, на сегодняшний день секвенирование ДНК и РНК — это во многом рутинная процедура, которая служит лишь в качестве одного из множества методов современной молекулярной биологии и биотехнологии. Используемые сегодня методы секвенирования НК позволяют оценивать не только последовательность ДНК, но и экспрессию кодируемых ею молекул РНК (транскриптом), а также разнообразные типы модификаций генома и транскриптома, такие как метилирование, тесно связанное с активностью генов. В то же время перед учеными то и дело встают новые задачи. Так, несмотря на генетическую идентичность клеток в одном организме, иногда требуется оценить разницу между одиночными клетками и их субпопуляциями; более того, последние исследования показали, что из ста триллионов клеток, составляющих человеческое тело, не найдется и двух с полностью одинаковым геномом — из-за мутаций, накапливающихся в эмбриогенезе и в течение жизни организма [14].

Дело в том, что большинство широко применяемых методов анализа нуклеиновых кислот позволяет работать с тканями, которые состоят из абсолютно разных клеточных субтипов. При этом, анализируя образцы ДНК или РНК из таких экстрактов, ученые получают некие усредненные результаты и редко могут прицельно дотянуться до конкретной функции или механизма.

В результате исследователи, обращаясь к классическим методам глубокого секвенирования, нередко сталкиваются с трудностями — например, при анализе геномов некультивируемых микроорганизмов, изучении генетического мозаицизма [14] или геномном анализе клеточных субпопуляций раковых опухолей. Связаны эти трудности, как правило, с биоинформатическим анализом данных, а иногда эксперименты вовсе не дают необходимых результатов [15]. Не меньше проблем у ученых до недавнего времени возникало в ходе анализа экспрессии генов или метилирования в комплексных тканях, состоящих из разных типов клеток (например, тканях головного мозга), или в тканях, пронизанных кровеносными сосудами [16], [17].

Ответом на все эти вызовы стали технологии одноклеточного секвенирования (ОКС). Они позволяют получать информацию о многомерности тканей, выявляя различия в клеточных популяциях, и оценивать клеточные взаимосвязи, а не получать лишь среднее значение для многих клеток, теряя информацию об их гетерогенности, как это было раньше. И если еще недавно широкое распространение ОКС сдерживалось его высокой стоимостью, то по мере появления новых методов пробоподготовки и секвенирования сегодня данный подход используется всё чаще [18].

Одноклеточное секвенирование можно разделить на четыре важнейших этапа:

На протяжении всех четырех этапов важно обращать внимание на ряд экспериментальных параметров и критических точек, следование которым позволит провести успешный эксперимент и получить достоверные данные [19].

Пожалуй, одним из важнейших этапов при одноклеточном секвенировании является пробоподготовка, поскольку она может в значительной мере повлиять на результат. Например, ткани с высокими показателями адгезии между клетками должны быть тщательно диссоциированы до одноклеточного уровня. С другой стороны, экспериментатор должен отдавать себе отчет в том, что более разрушительные методы суспендирования клеток могут иметь фатальные последствия для результатов, приводя к гибели части клеток и тем самым нарушая соотношения субпопуляций в ткани. На сегодняшний день для диссоциации тканей используют три основных подхода: ферментативный (обработка биологического образца ферментами, разрушающими межклеточный матрикс, — коллагеназой, эластазой, трипсином и другими), механический (диссекция клеток, пипетирование, центрифугирование и др.), а также комбинированный, который включает в себя первые два.

Кроме того, в некоторых случаях необходима не только диссоциация клеток и приготовление их суспензий, но и «обогащение» редко представленных клеточных субпопуляций в общем клеточном пуле, а также элиминация мертвых клеток. Для этих случаев может быть использована целая плеяда методов, которые позволяют идентифицировать определенную субпопуляцию клеток, основываясь на их массе, размере, плотности. Различные флуоресцентные метки, в свою очередь, применяются для идентификации и последующей сортировки определенных типов клеток [20].

Широкое распространение при подготовке биологических образцов к ОКС получили методы проточной цитофлуориметрии. Проточная цитометрия является ценным инструментом для контроля качества, поскольку с ее помощью одновременно можно оценивать множество показателей, включая размер клеток, их жизнеспособность, а также адгезию между клетками. Подробнее о методах цитометрии можно почитать в ранее опубликованной на «Биомолекуле» статье «12 методов в картинках: проточная цитофлуориметрия» [21].

Chromium Controller: как анализировать множество клеток сразу

Прибор Chromium Controller от компании 10x Genomics способен быстро разделять клетки по отдельным каплям и баркодировать их ДНК, что позволяет проводить параллельный высокопроизводительный анализ десятков тысяч клеток.

Рисунок 1. Схема работы прибора Chromium Controller для секвенирования ДНК отдельных клеток или ядер

Прибор компактен и очень прост в использовании: всё, что требуется пользователю — это правильно загрузить чип и поместить его в прибор. В чип вносят клетки, реагенты (гелевые частицы) и масло (рис. 1).

Весь эксперимент можно разделить на пять этапов:

Материал предоставлен партнером — компанией «СкайДжин»

После лизиса из каждой клетки выделяется генетический материал, используемый для приготовления ДНК-библиотек. Поскольку каждая клетка содержит лишь один диплоидный геном, его необходимо предварительно амплифицировать, так как современные платформы для секвенирования не позволяют работать с одной или двумя копиями генома (рис. 2). Для наработки достаточного количества копий при пробоподготовке используют разнообразные методы полногеномной амплификации (whole genome amplification, WGA), позволяющие избежать значительного количества ошибок, — например, изотермическую ПЦР. В случае работы с различными типами РНК пул транскриптов предварительно переводят в комплементарную ДНК (кДНК) при помощи обратной транскриптазы, а затем также амплифицируют отдельно для каждой клетки. В настоящее время особой популярностью по-прежнему пользуется метод амплификации со множественным замещением цепи (multiple displacement amplification, MDA) с применением полимеразы phi29 (выделенной из одноименного бактериофага). Данная полимераза славится своей высокой процессивностью, малым количеством ошибок и широтой покрытия генома (около 84%) [24].

Другой метод полногеномной амплификации, известный под аббревиатурой MALBAC (Multiple annealing and looping-based amplification cycles), объединяет в себе MDA и обычную ПЦР и дает возможность не только амплифицировать значительную часть генома (более 50%) или транскриптома, но и добиться высокой равномерности покрытия и меньшей частоты потери аллелей относительно использования полимеразы phi29 [24] — она предпочтительно амплифицирует один аллель в гетерозиготном состоянии.

Таким образом, MDA и MALBAC имеют как преимущества, так и недостатки, а поэтому должны применяться в зависимости от целей эксперимента.

Рисунок 2. Основные этапы подготовки образцов ДНК и РНК для одноклеточного секвенирования

После выделения и амплификации НК для каждой анализируемой клетки исследователь должен выбрать дальнейшее направление пробоподготовки, которая в будущем определит методику секвенирования. Сегодня на биотехнологическом рынке представлены самые разные технологии определения последовательности НК, способные решать стоящие перед исследователем задачи. Вот главные из них:

Первые четыре технологии подробно рассмотрены ранее на «Биомолекуле» («12 методов в картинках: секвенирование нуклеиновых кислот» [2] и «Нанопоровое секвенирование: на пороге третьей геномной революции» [10]), тогда как технология сPAS, выведенная на рынок коммерческих приборов китайской компанией BGI Genomics, вошла в повседневный обиход лишь несколько лет назад, но уже слегка потеснила технологию массового секвенирования, предлагаемую компанией Illumina.

На примере работы с геномной ДНК суть метода cPAS (рис. 3) заключается в следующем. К обоим концам предварительно фрагментированной ДНК (около 500 пар оснований) лигируют адаптеры. Затем полученную библиотеку циркуляризируют и амплифицируют, используя ранее упомянутый метод с множественным замещением цепи (MDA) по принципу катящегося кольца, то есть исходный фрагмент прочитывается многократно. Такой подход позволяет избежать клонального накопления ошибок полимеразы. После того, как количество амплифицированных фрагментов достигнет нескольких сотен, они укладываются с использованием запатентованной технологии в ДНК-наношарик (DNA nanoball, DNB) [25].

Рисунок 3. Технология cPAS-секвенирования. Фрагментированная геномная ДНК лигируется с четырьмя адаптерами, формируя кольцевую ДНК-библиотеку. ДНК-наношарик формируется путем репликации по принципу катящегося кольца. Каждый ДНК-наношарик помещается в определенное место на ячейке секвенатора. Считывание ДНК осуществляется с использованием принципов гибридизации и лигазного секвенирования.

Полученные ДНК-фрагменты, компактизированные в виде ДНК-наношариков, наносятся на проточную ячейку секвенатора, где закрепляются за счет электростатических сил. На проточной ячейке проводят циклический процесс секвенирования, в котором объединяются принципы гибридизации и лигазного секвенирования. Реакционная смесь для синтеза комплементарной ДНК подается на поверхность проточной ячейки и содержит ферменты, а также четыре типа флуоресцентно меченых проб, состоящих из нуклеотидов универсальной специфичности (способных связаться с любым из нуклеотидов матричной ДНК), а также одного известного нуклеотида (A, T, G или С) на 5′-конце. После гибридизации пробы и специфичного нуклеотида лигирования по 5′-концу камерой с ПЗС-матрицей считывается флуоресценция пробы, а затем универсальные нуклеотиды и флуоресцентный краситель смываются. Эта серия шагов продолжается определенное количество раз, число которых задает пользователь [25].

Биоинформатический анализ данных одноклеточного секвенирования

Биоинформатический анализ данных одноклеточного секвенирования, несмотря на идеологическое сходство с классическим, рутинным анализом транскриптома в тканях и клеточных культурах (подробная информация представлена в классическом обзоре: A survey of best practices for RNA-seq data analysis [26]), представляет собой не самую тривиальную часть эксперимента, и в рамках данного обзора крайне сложно пройтись по всем подводным камням, которые ожидают компьютерного биолога. Уж слишком много приложений одноклеточного секвенирования существует сейчас, да и каждое конкретное исследование, ткань или модель требуют особого подхода.

Важный момент при анализе данных одноклеточного секвенирования — необходимость нормализации изучаемых образцов. Дело в том, что в ходе экспериментальных процедур (сепарация клеток, выделение НК, полногеномная амплификация и создание библиотек) существует значительная вероятность ошибок. Эти, казалось бы, незначительные этапы в дальнейшем могут существенно влиять на ширину и глубину покрытия генома/транскриптома, на смещение в числе определенных типов клеток и их субпопуляций, а также на соотношение аллелей. Данные проблемы решаются воспроизводимостью экспериментальных процедур, добавлением технических и биологических повторностей, а также использованием дополнительных математических методов [19].

При геномном секвенировании глубина покрытия отдельных клеток значительно меньше, чем в массовых экспериментах. Таким образом, увеличение разрешения до клеточного уровня с использованием технологий ОКС означает также снижение достоверности обнаруживаемых механизмов, которые становятся более стабильными, когда суммируются (например, при анализе ткани). В конечном счете, задачи, которые ранее казались рутинными (например, поиск единичных нуклеотидных вариаций или геномных перестроек в субпопуляциях опухоли), требуют значительной методологической осторожности при обращении с данными одноклеточного секвенирования [27].

Так же как и при геномном секвенировании, анализ транскриптомных данных ОКС теоритически позволяет получить полное представление о взаимодействии транскриптов внутри отдельных клеток. Однако анализ экспрессии генов единичных клеток зачастую страдает от недостаточного покрытия, что в результате объединяет два различных типа нулевых значений в экспрессии конкретного транскрипта:

Во многом результаты транскриптомных исследований на одноклеточном уровне (впрочем, как и геномных) напрямую зависят от лабораторной части эксперимента, используемой платформы для пробоподготовки и секвенирования, глубины секвенирования, уровня экспрессии конкретного гена и так далее [27].

Подводя итог, можно сказать, что одноклеточное секвенирование НК может выявить сложные и редкие популяции клеток, найти регуляторные взаимосвязи между генами и отследить траектории развития отдельных клеточных линий. Дальнейшие технические усовершенствования на уровне молекулярной и клеточной биологии и доступных биоинформатических инструментов значительно облегчат как фундаментальные исследования, так и прикладное применение (медицина и биотехнология) этих технологий секвенирования [19].

Пространственная транскриптомика: новый шаг вглубь клетки и её машинерии

Распознавание пространственно-временных паттернов экспрессии генов имеет решающее значение для понимания основных биологических принципов от эмбриогенеза до возникновения и протекания болезней. Новые методы пространственной транскриптомики в единичных клетках расширяют наши знания о молекулярных процессах, протекающих внутри клеток и во внеклеточной среде. Эти подходы позволяют, например, реконструировать в цифровом виде паттерны эмбриональной экспрессии в 3D и успешно идентифицировать новые домены экспрессии, типы клеток и особенности тканей. Такие технологии открывают путь к беспристрастному и исчерпывающему анализу уровней экспрессии генов в пространственном и количественном выражении, способствуют пониманию функционирования генома и эпигенома в клетке.

Подробнее о роли микроокружения в прогрессировании онкологических заболеваний можно почитать здесь: «Опухолевые разговоры, или Роль микроокружения в развитии рака» [22].

Современные методы молекулярной биологии, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и микроскопии позволили не только анализировать синтез молекул РНК из отдельных тканей или отдельных клеток, но и визуализировать их в живых системах. Подобная визуализация in vivo может быть осуществлена посредством гибридизации меченого зонда, комплементарного транскриптам-мишеням. Более того, современные системы считывания анализа флуоресценции (например, сложные зонды, использующие комбинации флуорофоров) позволяют избегать спектрального перекрытия различных меток и тем самым анализировать значительное количество мишеней в клетке. В то же время этот подход не подходит для идентификации положения всех транскриптов в клетке [31].

Общей проблемой методов, основанных на FISH, считается их высокая цена и связанная с ней ограниченность в выборе транскриптов, а также высокий уровень фона аутофлуоресценции в непрозрачных образцах тканей [30].

Методы флуоресцентной гибридизации in situ, как показала практика, имеют существенные ограничения по числу реализующихся транскриптов, которые возможно описать. Поэтому были предложены другие методы, основанные на идентификации положения транскриптов в клетке, их захвата и последующего секвенирования ex situ. Такая концепция реализована в нескольких методологических подходах, где возможен анализ всего транскриптома. Однако основным препятствием для продвижения этих методов долгое время являлась ограниченная эффективность захвата РНК, которая становится всё более сложной при более высоком разрешении.

Первый способ пространственной транскриптомики был опубликован в 2016 году и в настоящее время коммерциализирован компанией 10x Genomics под названием 10x Visium. Суть данной методики заключается в приготовлении тонких (10–50 мкм) гистологических срезов и нанесении их на специальные предметные стекла с иммобилизованными на них поли-dT-олигонуклеотидами, для каждого из которых известно местоположение по Х- и Y-осям, и каждый из которых имеет специфический баркод. В дальнейшем ткань фиксируется, окрашивается и визуализируется (рис. 4).

Рисунок 4. Пример использования пространственной транскриптомики при анализе экспрессии генов в тканях префронтальной коры головного мозга человека. С помощью набора реагентов для пермеабилизации происходит снижение проницаемости клеточных мембран, и информационные РНК (матричные РНК, мРНК) диффундируют вниз к твердой поверхности слайда, локально гибридизуясь с иммобилизованными на его поверхности поли-dT-олигонуклеотидами. Затем методом обратной транскрипции проводится синтез кДНК и другие этапы подготовки библиотеки для последующего секвенирования с использованием одной из популярных платформ. Данные в дальнейшем экстраполируются на изображение среза ткани, полученное в начале эксперимента, предоставляя тем самым информацию о расположении конкретного транскрипта в клетке [32].

Области применения технологий single cell sequencing от компании 10x Genomics

Анализ уровня экспрессии единичных клеток, как и анализ пространственной экспрессии генов, может применяться для исследований в различных областях, включая:

Нейробиология

Нервная система — это сложная сеть, состоящая из различных типов клеток, которые имеют множество сигнальных путей и синаптических взаимодействий. При нарушении функций или взаимодействий компонентов центральной нервной системы (ЦНС) возникают нейродегенеративные заболевания, причем их причиной может послужить как травма, так и заболевание или генетическая вариативность (рис. 5).

Рисунок 5. Нейробиология — широкое поле для исследований

Традиционные методы изучения клеточных типов и подтипов в нервной ткани — это иммуногистохимия, гибридизация in situ, анализ на микрочипах. Эти технологии основаны на детекции небольшого количества известных мишеней, таких как клеточные маркеры, миелинизированные аксоны или амилоидные бляшки, и требуют большого количества образца для анализа. Также эти методы не могут предоставить информацию о гетерогенности клеточных субтипов и их уровней экспрессии.

В то же время анализ на уровне единичных клеток позволяет:

Онкология

Несмотря на огромное количество исследований в области онкологии, у ученых всё еще остается множество вопросов. Какие механизмы лежат в основе возникновения и прогрессии опухоли? Как различная реакция на терапию может быть применена к разным пациентам с различными типами опухолей? Как идет метастазирование в зависимости от типа опухоли и особенностей больного? Ответить на эти и многие другие вопросы может анализ на уровне единичных клеток. 10x Genomics разработала ряд готовых протоколов для различных задач:

Иммунология

На фронте многих важных научных и медицинских достижений находятся исследования в области иммунологии, такие как профилирование новых патогенов, разработка вакцин, разработка иммуноонкологических методов лечения, изучение аутоиммунных заболеваний, подбор тканей для безопасной трансплантации органов и многое другое. Область действительно масштабная по своим направлениям, ниже представлены некоторые из них с точки зрения анализа на уровне единичных клеток:

Инфекционные заболевания. Узнайте, как патогены заражают клетки-хозяева и вызывают иммунные реакции. Свяжите иммунный ответ хозяина с выздоровлением или тяжестью инфекции.

Аутоиммунные реакции. Расшифруйте основные механизмы неправильно направленных иммунных реакций. Исследуйте патофизиологию заболеваний в отдельных клетках и системах органов.

Трансплантология. Контролируйте клиническое ведение трансплантации органов или гематологических стволовых клеток. Изучите иммунологическую основу заболеваний, связанных с трансплантацией.

Поиск новых лекарств. Определите репертуар рецепторов и антигенную специфичность адаптивных иммунных клеток. Ведите разработку вакцин, выявляйте профилактические антитела и проводите целенаправленную иммунотерапию.

Клеточная и молекулярная иммунология. Ведите фундаментальные исследования иммунной системы в области здоровья и болезней. Характеризуйте разнообразие, функции и организацию иммунных клеток в организме.

Аллергии и воспаление. Исследуйте особенности врожденной и адаптивной иммунной активации. Расшифруйте механизмы иммунной гиперактивации в ответ на аллерген или травму.

Иммуноонкология. Определите инфильтрирующие иммунные клетки в микроокружении опухоли. Охарактеризуйте функции иммунных клеток и репертуар рецепторов.

Материал предоставлен партнером — компанией «СкайДжин»

Кроме описанного выше, существуют и другие методы пространственного секвенирования. Один из них (Slide-Seq) использует магнитные шарики с иммобилизованными поли-dT-олигонуклеотидами, на которых проходит считывание. Шарики случайно наносятся на слайд, и их местоположение декодируется перед началом нанесения на этот слайд образца [33]. Не менее интересной выглядит технология GeoMx, которая уже показала свою эффективность при работе со сложными образцами из парафиновых блоков. Кроме анализа экспрессии генов платформа GeoMx Digital Spatial Profiling (DSP) также предоставляет возможность пространственного профилирования белков. В процессе работы пользователь вручную выбирает интересующие его области клетки с помощью микроскопии. Затем эти области обрабатываются УФ-светом, вызывая высвобождение либо РНК-зонда связанного с транскриптом-мишенью, либо белка, помеченного антителом [34].

Биоинформатический анализ данных при пространственном транскриптомном анализе

Клетки разных типов пространственно и структурно организованы в тканях и выполняют свои разнообразные функции. Расшифровка сложной пространственной архитектуры гетерогенной ткани важна для понимания клеточных механизмов и функций в норме и при различных заболеваниях. Быстрое развитие технологий scRNA-seq позволило начать крупномасштабные исследования гетерогенных клеток и работ по отслеживанию родственных связей внутри ткани. К сожалению, из-за отсутствия пространственной информации scRNA-seq не способен идентифицировать структурную организацию гетерогенных клеток в сложной ткани. Поэтому в качестве дополнения к scRNA-seq были введены методы пространственного профилирования транскриптома. Чтобы выявить пространственную цитоархитектуру в тканях, используют описанные выше технологии, позволяющие проводить количественный анализ транскриптома с пространственным разрешением в отдельных срезах ткани. Технологические новшества и новые подходы в пространственной транскриптомике открыли неизведанный ландшафт, где транскрипционная информация помещается в пространственный контекст. Кластеризация — центральный компонент при анализе данных этого типа. Однако выбор количества кластеров для использования и интерпретация их взаимосвязей могут быть затруднительны [35], [36].

Новые технологии пространственной транскриптомики могут пространственно индексировать транскрипты и измерять профили экспрессии, улучшая наше понимание точной архитектуры тканей. Однако разрешение данных пространственной транскриптомики намного ниже, чем уровень одиночной клетки. Транскрипты, захваченные в определенном месте, обычно представляют смесь из 10–20 клеток. В результате измеренные экспрессии генов отражают хоть и небольшую, но смесь клеток. Следовательно, выявление клеточных составов в каждой точке данных ST имеет решающее значение для исследования молекулярной и клеточной архитектуры ткани с высоким разрешением [36].

К настоящему времени для кластеризации и визуализации данных разработано не так много программных продуктов, хотя определенные успехи в этой области уже появляются, в частности, с использованием искусственного интеллекта и математических моделей удалось определить расположение клеток и транскриптов, синтезируемых в них (рис. 6) [36].

Рисунок 6. Различные уровни разрешения и различные результаты, получаемые в зависимости от использованных методов

Заключение

С появлением NGS-технологий в начале века человечество получило ключи и новые возможности для понимания молекулярных процессов, управляющих жизнью, однако анализ геномов, транскриптомов или эпигеномов представлялся серьезной проблемой при анализе комплексных тканей (кровь, нервная ткань) и органов, состоящих из различных субпопуляций клеток, различающихся по своему функционалу, а значит, и по тем генам, которые в них задействованы. Новые технологии одноклеточного секвенирования и пространственной транскриптомики придают новый импульс развитию современной геномики [18].

Технологии одноклеточного секвенирования дают уникальную возможность изучать молекулярную активность отдельных нервных клеток, визуализируя нейроны во времени и пространстве. Это позволяет изучать эволюцию головного мозга [37], идентифицировать различные типы нейронов и связанных с ними клеток в мозге. На сегодняшний день в головном мозге обнаружено большое число молекулярных типов нейронов, подтипов глиальных клеток [38], [39]. Ожидается, что понимание их работы на молекулярном уровне приблизит врачей к пониманию причины возникновения ряда заболеваний головного мозга, таких как шизофрения [40], болезни Альцгеймера [41] и Паркинсона [42].

Немаловажно использование технологий одноклеточного секвенирования в анализе причин и механизмов течения ряда генетически обусловленных заболеваний человека, в частности, онкологических. Исследования последних лет показали, что генетические или геномные вариации могут приводить к образованию клеток с различными характеристиками в опухолевой ткани, что делает опухолевую ткань очень гетерогенной. Такая высокая степень гетерогенности может быть связана с механизмами онкогенеза и метастазирования, поэтому исследования клеточных субпопуляций, населяющих опухоль, крайне важны [48]. Традиционные методы секвенирования позволяют получать среднее значение сигналов в опухолевой ткани, и генетическая неоднородность опухолевых клеток часто маскируется генетическим материалом наиболее представленной субпопуляции клеток опухоли. Технологии одноклеточного секвенирования могут прекрасно компенсировать недостатки традиционных методов расшифровки генома. Клеточная карта опухолевых клеток может быть построена путем обнаружения гетерогенности опухолевых клеток и пространственной транскриптомики. Технологии ОКС уже сейчас используются при исследовании различных опухолей и имеют большое значение для разработки новых методов диагностики и терапии [48], [49].

Анализ геномного разнообразия прокариот для комплексных образцов — также одна из основных мишеней одноклеточного секвенирования из-за сложности культивирования большинства микроорганизмов. Геномика единичных клеток — это мощный способ получения последовательностей геномов прокариот в отрыве от разработки сложных способов культивирования в лаборатории. Этот подход широко применяется к морским, почвенным, подземным, организменным и другим типам микробиомов для решения широкого круга вопросов, связанных с экологией и эволюцией микроорганизмов, здоровьем человека и потенциальным применением в биотехнологии [50].

Источник