Что такое вирусная мозаика

Мозаика

Вирус мозаики: как бороться с одним из самых опасных заболеваний

Мозаика — это вирусное заболевание, которое угрожаем широкому ряду растений. Принято разделять на обыкновенную, крапчатую, белую, табачную, морщинистую и полосатую мозаику. Среди растений-хозяев вируса: картофель, огурцы, фасоль, капуста, свекла, лук, кабачки, бананы, кустарниковые растения и другие культуры. Мозаика является типичным членом большой группы вирусов в роду Tobamovirus. Частицы вируса в форме палочек (вирионы) имеют размеры около 300 нм х 15 нм. Одна частица состоит из 2130 копий белка оболочки, который охватывает молекулу примерно из 6400 нуклеотидов.

Вирусные инфекции могут снизить энергию растений, нарушая клеточные функции, но обычно не убивают растения. Табачная мозаика является одним из наиболее стойких заболеваний, поскольку она может оставаться жизнеспособной без хозяина в течение многих лет и способна противостоять высокой температуре.

Вирус табачной мозаики на томатах

Болезни георгинов.Вирус мозаики.Сайт «Садовый мир»

Это интересно

Мозаика был первым вирусом, обнаруженным более ста лет назад, и первым вирусом, который удалось очистить. С тех пор он дал захватывающую информацию о том, как вирусы заражают своих хозяев. Исследования вируса мозаики привели к крупным открытиям и Нобелевской премии по общим принципам существования вирусов.

Распространение

Мозаика распространена по всему миру. В умеренных, субтропических и тропических странах. Вирус мозаики был зарегистрирован Австралия, Острова Кука, Фиджи, Французская Полинезия,Соломоновы Острова, по всей Европе и территории Америки.

Симптомы

Симптомы, вызванные вирусом мозаики, в некоторой степени зависят от растения-хозяина и могут включать пятнистость, некроз, задержку роста, скручивание листьев и пожелтение тканей растения. Симптомы очень зависят от возраста зараженного растения, условий окружающей среды, штамма вируса и генетического фона растения-хозяина. Симптомы мозаики бобов проявляются в виде отчетливых темных и желтовато-зеленых областей. Зараженные растения часто имеют ярко-желтые пятна, которые усиливаются в цвете с возрастом растения. Различные штаммы вируса вызывают различные симптомы, такие как слабая желтая мозаика и задержка роста или искажение листьев и сильное замедление роста. Симптомы стручка появляются на светло-зеленой пятнистости и могут быть неправильно сформированы. Штаммы мозаики томатов вызывают плохую урожайность или искаженные плоды, задержку созревания и неоднородный цвет плодов.

У банана наблюдаются желтые полосы и пятна, иногда с легким искажением. Обычно симптомы появляются только на нескольких листьях.

В противоположность этому, у двудольных культур симптомы листьев различны. Например, на тыкве, у некоторых листьев есть слабые пятна похожие на вены, у других — большие желтые области или искажения с желтыми и темно-зелеными пятнами.

Как вирус мозаики передается

Вирус проникает в растения через раны, полученные при пересадке или обрезке. Распространяется быстро, как только оказывается в хозяине. Вирус может оставаться жизнеспособным в течение многих лет на высушенных растительных остатках, и чрезвычайно устойчив к очень высоким температурам. Вирус мозаики может загрязнять семенную оболочку, и растения, прорастающие из этих семян, могут легко заразиться. Он быстро и непостоянно передается несколькими видами тли. Это означает, что тле требуется всего несколько секунд, чтобы заразиться вирусом, и затем они передают его при следующем кормлении. Однако они быстро теряют способность распространять вирус таким образом. Такое заражение называется «непостоянным». Вирус не размножается внутри тли.

Мозаика очень легко передается, когда зараженный лист соприкасается с листом здорового растения, загрязненными инструментами, а иногда и рабочими. Вирус мозаики необычайно устойчив.

Вирус соевой мозаики не может выжить вне живой клетки, и его распространению не способствует ветер, вода, почва или растительный мусор. Вирус выживает в семенах и внедряется в поле путем использования зараженных семян. Передача семян может достигать 75% у наиболее восприимчивых сортов. Показатели передачи семян у современных сортов сои колеблются в пределах 0-5%. Попав в поле через зараженные семена, тля может передавать болезнь от растения к растению.

Вирус соевой мозаики и вирус стручковой фасоли действуют синергетически. Заражение обоими вирусами вызывает тяжелые симптомы, и растение может погибнуть. Коинфекция обоих вирусов повысила потерю урожайности до 86% и увеличила скорость передачи семян.

Методы борьбы

Борьба с вирусом огуречной мозаики сложна. У него широкий спектр хозяев, инсектициды не препятствуют его распространению, есть несколько штаммов. Как только растения заражены и проявляют симптомы, уже невозможно восстановить их здоровье, поэтому важно предотвратить заражение.

Садоводческие практики

Культурный контроль

Перед посадкой используйте только не содержащие вирусов семена. Если семена хранятся от предыдущего урожая, убедитесь, что они взяты из растений, которые не имели симптомов вируса.

Старайтесь не сажать какие-либо культуры, которые, как известно, восприимчивы к вирусу мозаики, рядом со старыми культурами восприимчивых видов; если вы это сделаете, тля быстро переносит вирус на новый урожай.

Проверьте рассаду на наличие симптомов вируса мозаики; если найдено, удалите и уничтожьте растения. Регулярно (каждые 2-3 дня) проверяйте растения, посаженные в поле.

Но будьте осторожны при обращении с зараженными саженцами. Часто мойте руки и инструменты водой с мылом.

Прополка вокруг посевов в поле может быть эффективной, так как многие сорняки являются хозяевами вируса мозаики. Обратите внимание, что некоторые сорняки не проявляют симптомов, но все же могут быть источником вируса.

После сбора урожая соберите и уничтожьте остатки урожая и другие растительные остатки и сожгите их.

Прививка умеренного штамма вируса на молодые растения может защитить их от последующего заражения более тяжелыми штаммами мозаичного вируса. Это хорошо документированная стратегия управления, называемая «перекрестная защита», которая успешно применяется в тепличных операциях.

Биотехнология

Методы генной инженерии предоставили ученым возможность экспрессировать ген белка оболочки вируса в трансгенных растениях табака и томата. Эта стратегия контроля может защитить растения от заражения близкородственными штаммами.

Устранение инокулята

В экспериментальных условиях было доказано, что вирус мозаики может быть инактивирован, когда рабочие опускают загрязненные руки в молоко перед посадкой. Этот недорогой метод значительно снижает заболеваемость. Саженцы, которые, как известно, более восприимчивы, и не должны пересаживаться в почву, содержащую загрязненный вирусом корень или растительный мусор.

Разведка на болезни. В течение вегетационного периода зараженные растения должны быть выкопаны, упакованы в мешки и удалены с поля. Практика севооборота, которая включает устойчивые растения или не принимающие культуры, также должна применяться для уменьшения количества инокулята в поле.

Управление при сборе и хранении урожая

Источник

Табачная мозаика

Табачная мозаика на огурцах

Открытие в 1886 году вируса табачной мозаики и начало его изучения стали основой для развития современной вирусологии. За это время в науке проведено много исследований, определивших влияние разных вирусов не только на растения, но и на человека и животных.

Впервые действие вируса табачной мозаики было изучено на табаке – представителе семейства пасленовых. Сегодня болезнь поражает более 350 видов различных овощных, садовых, декоративных растений, а также однолетние и многолетние сорняки.

Прежде всего, вирус поражает в листьях слабые клетки, в которых мало глюкозы и органических кислот. Из-за этого меняется процесс фотосинтеза и разрушается хлорофилл. Пораженные листья покрываются мозаичными разводами и бугорками. Темно-зеленые участки чередуются с бежевыми, светло-зелеными или желтыми пятнами. Внешне эти признаки похожи на борное голодание.

В результате поражения защитного слоя клеток растение в целом слабеет, истончается и не может противостоять проникновению внутрь других бактерий. Вирус табачной мозаики снижает урожайность, ухудшает товарный вид плодов.

Причины

Как же инфекция попадает на здоровые растения? Это происходит естественным путем и с помощью человека.

Главные переносчики вируса при естественном распространении – вредные насекомые: тля, цикадки, клещи, трипсы, червецы, нематоды. Они питаются растительными соками и, высасывая питательную жидкость из заболевших растений, захватывают вирус. Он сохраняется в переносчике в течение нескольких часов и попадает на здоровое растение при перемещении вредителя к новому источнику питания.

Помимо вредителей инфекция разносится через пыльцу, семена, растительные остатки и сорняки.

При участии человека болезнь распространяется при вегетативном размножении, если используются зараженные луковицы, клубни, черенки, подвои и привои. Даже при неудачной прививке, если не произошло срастания, инфекция успевает попасть в здоровые ткани. Замечено, что заражение происходит быстрее на травянистых растениях, чем на деревьях, и легче на молодых, чем на старых экземплярах.

Часто распространение происходит с помощью садового инвентаря: прививочного ножа, секатора и ножниц при проведении обрезки, когда садоводы игнорируют их дезинфекцию.

Табачная мозаика на разных растениях

Огурцах

На огурцах табачная мозаика встречается реже, чем на пасленовых культурах. Признаками болезни является появление на листьях мраморной окраски – бледно-желтых разводов на ярко-зеленом фоне. Зеленые части листьев, не изменившие свой цвет, покрываются пузырями.

В итоге лист высыхает и отмирает. Плоды плохо завязываются, большинство из них опадает. Уцелевшие плоды вырастают мелкими и уродливыми.

Томатах

Вирусом табачной мозаики болеют томаты, как в теплицах, так и в открытом грунте. В середине июня можно заметить остановку роста кустов.

Листочки на верхушке истончаются и закручиваются. Их окраска меняется с зеленой на желто-зеленую, а сами листья напоминают кружево. У некоторых сортов на черешках и стеблях появляются темные пятна или некротические участки.

На плодах внешние признаки болезни не всегда заметны. Они созревают неравномерно и могут осыпаться. При сильном заражении на плодах, растущих на первых двух нижних кистях, появляются желтые, а затем бурые пятна. Побурение, похожее на темную сетку, затрагивает внутренние стенки.

Перцах

Больше всего от табачной мозаики страдают перцы в теплицах. При поражении вирусом вся поверхность листа покрывается крупными желтыми и белыми пятнами. Эти участки хаотично чередуются с зеленой окраской. Листочки могут деформироваться, чернеть и опадать.

На черешках и стеблях заметны темные штрихи и некротические участки. Из-за вируса снижается урожайность, плоды плохо развиваются, на них появляются вдавленные коричневые пятнышки.

Капусте

Табачной мозаикой поражается большинство видов капусты. Уже на стадии рассады могут появиться первые признаки болезни.

На листочках возле прожилок образуются светлые и некротические пятна. Они постепенно распространяются на остальную поверхность листа и сливаются. Основная прожилка деформируется и лист сморщивается.

Яблоне

Вирус табачной мозаики проявляется на молодых яблонях. Весной распустившиеся листочки покрываются желтыми или бледно-зелеными полосками и пятнами. Окраска жилок при этом может не меняться.

Постепенно эти пятна становятся больше и распространяются на молодые побеги. Сильно пораженные листья сохнут и опадают. Начинается ранний листопад, и рост дерева замедляется.

Редисе

В результате вирусного воздействия в листьях разрушается хлорофилл – зеленый пигмент и их поверхность покрывается характерным для болезни мозаичным рисунком. Листья становятся зелено-желтыми с мраморными прожилками. Некоторые участки вздуваются из-за быстрого деления клеток.

Рост редиса замедляется, растение выглядит угнетенным. Корнеплодов образуется мало, они вырастают мелкими и деформированными.

Картофеле

В результате повреждения вирусами листья приобретают неравномерную мозаичную окраску. Зеленые участки чередуются с желтыми, белыми пятнами разного размера. Сначала изменение цвета затрагивает молодые листья, затем распространяется на весь куст.

На клубнях признаки болезни чаще всего отсутствуют, но урожай из-за поражения ботвы снижается.

Смородине

Главный признак вирусной болезни на смородине – появление на листьях в начале лета желтых или серо-желтых пятен и полосок. Хлоротичные участки постепенно отмирают.

Эти симптомы отчетливо видны при температуре воздуха ниже +21°C. При более высоких температурах признаки поражения проявляются слабо.

Цветах

Вирусом мозаики поражаются комнатные и садовые цветы, например, петуния, пеларгония, георгины, бегония.

На листьях цветов появляется пестрая расцветка. Пятна имеют разную форму и величину. Могут быть белого или желто-зеленого цвета. Изменяется форма листьев, они деформируются и заворачиваются краями наверх. Больные растения слабеют и отстают в росте.

Современные средства борьбы

Растения, пораженные вирусом табачной мозаики, спасти невозможно. В настоящее время пока нет средств, уничтожающих возбудителя инфекции раз и навсегда.

Все меры против болезни являются предупредительными. Главная задача огородника – укрепить защитные силы растений, так как заражаются, прежде всего, самые слабые из них. Не менее важна борьба с вредителями-переносчиками вируса.

Химические и биологические препараты

Новосил

Природный биостимулятор, который ускоряет прорастание семян, укрепляет корневую систему и растение в целом, обладает фунгицидными свойствами. Дозировка препарата для замачивания семян – 3 капли на 3 л воды, для опрыскивания овощей в период активного роста – 5–15 капель на 3 л воды.

Иммуноцитофит

Препарат повышает устойчивость к болезням и сопротивляемость к плохим погодным условиям, стимулирует рост растений и улучшает вкус плодов. Для обработки семян 1 таблетку растворяют в 1 ст. л воды. Этого объема хватит для замачивания 5 г семян.

Для обработки вегетирующих растений 1 таблетку заливают 1 ст. л воды. После полного растворения добавляют 2 л воды и опрыскивают листья.

Борная кислота

Это проверенное годами средство укрепляет и подкармливает растения, повышает выживаемость в стрессовых условиях, борется с вредителями и предотвращает инфекции. Норма расхода для обработки семян – 0,5 г на 1 л воды, для опрыскивания – 1 г на 1 л воды. Для борьбы с вредителями 1 ч. л борной кислоты и 3 ч. л сахара разводят в 1 стакане воды.

Народные методы

Профилактика

Помимо обработки семян, рассады и взрослых растений необходимо соблюдать следующие правила профилактики:

Вирус табачной мозаики отличается высокой жизнестойкостью. Он способен сохраняться в почве до 4-х лет. Пока ученые изобретают чудо-средство от вируса, огородникам поможет только правильный уход за растениями, внимательное к ним отношение и полный комплекс профилактических мероприятий.

Подробнее о табачной мозаике вы узнаете из видео.

Источник

Неприятно познакомиться: как появились вирусы и почему в России их меньше, чем в Китае

В любой энциклопедии написано: «вирус» в переводе с латинского языка означает « яд». С тех пор как в XIX веке исследователи впервые столкнулись с заражением одного организма другим, знания о вирусах множились. К настоящему времени ученые изучили порядка пяти тысяч видов вирусов, но сказать, что науке доподлинно известно и с чем она имеет дело, нельзя. В двадцать первом веке все еще остаются вопросы, на которые у ученых-вирусологов нет ответов. Ведь количество неизученных вирусов, которые «свободно парят» вокруг нас, находятся в воде, земле, в организмах животных, в стеблях растений, исчисляется миллионами!

— За всю историю исследований в основном изучались вирусы человека и сельскохозяйственных животных, — поясняет «Вечерке» вирусолог, директор Института медицинской паразитологии, тропических и трансмиссивных заболеваний им. Е. И. Марциновского Сеченовского университета Александр Лукашев. — А вирусы есть у каждого вида живых существ на Земле, в том числе у грибов, мхов, бактерий, простейших. И многие могут перейти к человеку.

Когда и при каких условиях тому или иному вирусу приспичит активизироваться — вопрос, не поддающийся прогнозам. Точнее, «паразиты» бомбардируют все живое постоянно. Вирусная атака — это процесс в природе непрекращающийся. Ведь вирус не бактерия и не микроорганизм. Это фрагмент генетической информации, упакованный в белковую оболочку. У него нет клетки, а значит, вне живого организма он как бы не живет, а находится в замершем состоянии. Поэтому если вы спросите у специалиста, живые вирусы или нет, он ответит уклончиво: как бы нет, но в общем-то да. Делиться самостоятельно вирус не может, и чужая клетка нужна ему, чтобы жить.

— Любая живая информация старается выжить в биосфере, — говорит вирусолог Александр Лукашев. — Главная эволюционная задача вируса — не уничтожить живую клетку, а, используя ее ресурсы, размножиться как можно в большем количестве своих копий. У вируса нет задачи быть «плохим». Наоборот, «хороший» вирус имеет преимущества. Например, вирус герпеса большинству людей практически не наносит вреда. Им заражены все, он распространен повсеместно, и свою функцию — максимально размножиться — он выполняет. А, скажем, вирус Эболы убивает примерно половину своих жертв, и в том числе и поэтому он не может размножиться в популяции человека. С точки зрения эволюции убивать своего носителя вирусу невыгодно. Клеткам живых организмов приходится держать глухую оборону практически постоянно. Но человек и не знает, что находится под обстрелом фрагментов генетической информации, потому что в подавляющем большинстве случаев клетки самостоятельно разбираются с захватчиком, не допуская заражения. Только с воздухом мы вдыхаем едва ли не ежесекундно десятки вирусов, и ничего.

— Вирусы редко переходят между видами нечасто, — говорит вирусолог Александр Лукашев. — Скажем, вирусы от растений к животным переходят, наверное, раз в один миллион лет. Бомбардировка новых видов происходит постоянно, но чаще всего безуспешно. Легче перейти к близкому виду. Например, от приматов к человеку вирусы переходят много раз в год. От млекопитающих — примерно раз в 10 лет. Ту же Эболу человек подхватывает от летучих лисиц. И вспомним свиной грипп и другие «болячки», перешедшие от животных. Случаи могут регистрироваться, например, и два года подряд, а потом 20 лет будет затишье, но я говорю о средней периодичности. Но на каждый успешный переход приходится, условно, миллион безуспешных.

— Скученность населения и, скажем так, очень близкий контакт между людьми и животными — в Китае совпали все условия. Из-за особенностей пищевых рынков и, возможно, более высокой восприимчивости населения «чужой» вирус «зацепился», а дальше из-за высокой плотности китайского населения смог распространиться, — рассуждает вирусолог Александр Лукашев. — У нас в стране совсем другие условия, хотя известно, что зараженные примерно такими же опасными вирусами летучие мыши обитают на юге России. Кроме того, мы летучих мышей и панголинов не едим, не разделываем и на рынках не продаем, а значит, и попыток перейти от животного к человеку их вирус может предпринимать значительно меньше. Гипотетически же к человеку может перейти огромное число вирусов — умножьте число всех видов млекопитающих на 1000 и примерно узнаете, сколько. Но если нет условий, выгодных для распространения заразы, бояться нечего.

Вместе с тем наука признала, что вирусы — это наследие древнего мира, существовавшего до появления первой живой клетки, четыре миллиарда лет назад. Более того, из вирусов или их остатков по большей части состоит геном человека. Это значит, что они были основой развития жизни на Земле. Доказано, что человек, как млекопитающее, обязан существованием именно им, поскольку благодаря вирусам у наших предков начала формироваться плацента. Как? Они привнесли в человеческий геном белок, отвечающий за ее функцию. Кроме того, вирусы сильно повысили эффективность эволюции. Они переносили генетическую информацию намного эффективнее, чем это делалось только в ходе естественного размножения. То есть удачные гены они передавали не потомству вида, а сразу в новый организм.

Вирусы мутируют. Ученые говорят, что у многих из них каждый новый геном имеет дополнительную мутацию. Изменяется вирус иногда в течение нескольких часов. Внутри одной клетки, внутри одного цикла размножения одинаковых вирусов нет! Чтобы иметь возможность приспособиться к новым условиям, вирус меняется, производя в популяции самые разные варианты. Мутация для вирусов — обязательная часть их жизненного цикла. Собственный геном вирусов в миллион раз меньше человеческого, и чтобы с нами конкурировать, они мутируют, создавая множество вариантов, которые могут «пригодиться» в разных условиях.

Источник

Что такое вирусная мозаика

В генной инженерии широко используется прием слияния различных белков в виде химерных полипептидов с последующим их расщеплением. Для расщепления химеров используются специфичные и недорогие ферменты. Одним из таких ферментов является каталитический домен белка ядерного включения (nuclear inclusion protein) вируса табачной мозаики. Фермент имеет молекулярную массу около 29 кДа и может быть получен в клетках E. coli [2, 3]. Однако белок при сверхэкспрессии, как и многие гетерологичные белки для E. coli, имеет тенденцию накапливаться в виде телец включения, что затрудняет его последующее извлечение из клеток в нативных условиях с сохранением каталитической активности [4]. В связи с этим, в литературе появились работы, использующие различные приемы для увеличения растворимости фермента в цитоплазме, в частности, имеется публикация, в которой авторы попытались внести мутации в структуру фермента с целью увеличения его накопления в цитоплазме [7]. Авторы смогли увеличить выход фермента в 5 раз, по сравнению с аналогичной системой, где использовался дикий тип гена. Так же известны работы, в которых фермент получали в виде слитого полипептида с мальтозо-связывающим белком (MBP) [3, 6]. Полипептид в клетке накапливался в цитоплазме и был способен к саморасщеплению и высвобождению TEV-протеазы. Следует так же отметить, что в этих работах использовался ген протеазы «дикого» типа. Мы предположили, что объединив эти две стратегии и оптимизировав структуру гена для экспрессии в клетках E. coli можно добиться существенного повышения уровня синтеза фермента в клетках. Таким образом, целью нашего исследования являлось конструирование продуцента на основе клеток E. coli с высоким выходом TEV-протеазы в растворимой форме.

Материалы и методы исследования

Получение рекомбинантной ДНК, кодирующей химерный полипептид MBP-TEV-протеаза. При конструировании модели рекомбинантной ДНК за основу была взята известная структура гена (giM15239.1(TEVGEN:6256-6981) в базе данных National Centerfor Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/335201). Анализ частоты встречаемости редких кодонов в геноме E. coli проводили с помощью программы интернет-ресурса «Классической и молекулярной биологии» (http://molbiol.ru/scripts/01_11.html). Рекомбинантная ДНК размером 792 п.н. была синтезирована из нуклеотидов по принципу «de novo» фирмой «DNA 2.0» (США) и была встроена в состав экспрессирующего вектора pD441-mbp. В результате в плазмиде под контролем промотора T5 в одной рамке считывания находилась рекомбинантная ДНК, размером 1890 п.н., кодирующая химерный полипептид MBP-TEV-протеаза (625 а.о., примерная молекулярная масса – 70 кДа).

Трансформация клеток E. coli. Трансформацию клеток полученной плазмидой проводили с помощью электропорации согласно методике фирмы – производителя прибора («PeqLab, BiotechnologieGmbH», Германия). Клоны E. coli, содержащие плазмиду, отбирали на селективной агаризованной среде LB (lysogeny broth), содержащей канамицин 30 мкг/мл.

Экспрессия химерного полипептида MBP-TEV-протеазы, наработка биомассы клеток продуцентов. Для экспрессии полипептида использовали клетки E. coli шт. BL21(DE3). Из отобранного клона E. coli выращивали ночную культуру в среде LB объемом 5 мл при 37 °С. На следующий день ночную культуру переносили в двухлитровую колбу с 500 мл свежей среды LB, содержащей канамицин 30 мкг/мл. Клетки выращивали при активном перемешивании и 37 °С до оптической плотности D600 = 0,8-1,2 о.е. Для анализа отбирали пробу (контроль) и добавляли индуктор – изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) до конечной концентрации в среде 0,5 мМ. Далее клетки инкубировали 4 ч при аналогичных условиях, либо при 300С. По окончании инкубации отбирали пробу для анализа (опытный образец). Клетки осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин, осадок использовали для выделения фермента. Клеточные лизаты и белки анализировали в 12 % полиакриламидном геле (ПААГ) по Лэммли, белки окрашивали красителем «Кумасси бриллиантовый синий R-250».

Выделение TEV-протеазы. Клетки E. coli в фосфатно-солевом буфере разрушали обработкой ультразвуком (УЗГ 13-0,1/22, ФГУП «ВНИИТВЧ», Россия). Клеточный лизат отделяли от дебриса центрифугированием 20 мин при 15000 об/мин. Дебрис экстрагировали 20 мин 8М мочевиной, осаждали 10 мин 10000 об/мин, супернатант использовали для анализа в ПААГ. Выделение и очистку фермента из лизата клеток осуществляли с помощью аффинной хроматографии на колонке с Ni-NTA-сефарозой CL-6B в нативных условиях, согласно протоколу фирмы-производителя аффинного сорбента «Quiagen» («Quiagen», Германия). Целевой белок элюировали фосфатно-солевым буфером, содержащим 250 мМ имидазола, 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты ЭДТА) и 2 мМ дитиотреитола (ДТТ), рН 7,5. От имидазола фермент очищали с помощью диализа в фосфатно-солевом буфере, содержащем 2 мМ ЭДТА и 2 мМ ДТТ. Концентрацию белка измеряли спектрофотометрически при λ = 280 нм. К ферменту добавляли равный объем 100 % глицерина, раствор перемешивали и хранили при – 20 °С.

Рис. 1. Фрагмент электрофореграммы белковых образцов на различных стадиях получения TEV-протеазы

Рис. 2. Фрагмент электрофореграммы лизатов клеток-продуцентов TEV-протеазы, инкубированных с индуктором различное время

Результаты исследования и их обсуждение

С целью оптимизации кодонов для экспрессии в клетках E. coli в структуру гена TEV-протеазы был внесен ряд замен – 34 синонимические замены кодонов, были заменены все кодоны с частотой встречаемости менее 10 кодонов на 1000. Кроме того, были сделаны четыре замены аминокислот согласно работам [2] и [7], а именно: S219V, T17S, N68D и I77V. Замена S219V уменьшает неспецифическую автокаталическую активность примерно в 100 раз по сравнению с диким типом фермента, тем самым фермент остается более стабильным [2]. Замены T17S, N68D и I77V приводят к большей цитоплазматической растворимости фермента, при сохранении его каталитической активности [7]. Для саморасщепления полипептида MBP-TEV-протеаза и последующей очистки фермента с помощью аффинной хроматографии с 5’-конца гена TEV-протеазы был добавлен фрагмент ДНК, кодирующий сайт эндонуклеазы рестрикции KpnI, глицин, сайт TEV-протеазы (ENLYFQ/G), 6 а.о. гистидина и глицин:

С 3’-конца гена был добавлен фрагмент ДНК, кодирующий стоп-кодон и сайт эндонуклеазы рестрикции XhoI:

В результате экспрессии гена химерного полипептида в составе экспрессирующего вектора в клетках E. coli шт. BL21(DE3) был получен рекомбинантный белок с молекулярной массой

29 кДа (рис. 1, дор. 3). Выход TEV-протеазы из биомассы, полученной индукцией клеток в течение 4 ч при 300С и концентрации индуктора 0,5 мМ, составлял

50 мг с литра культуры клеток (рис. 1, дор. 8). Следует отметить, что анализ экстракта осадка (дебриса) 8М мочевиной, после стадии разрушения клеток ультразвуком, не обнаружил фермента (рис. 1, дор. 4), фермент практически весь оставался в клеточном лизате (рис. 1, дор. 5). Это свидетельствует о том, что фермент являлся растворимым в цитоплазме и/или периплазме и не накапливался в тельцах включения.

Дорожки: 1, 9 – маркерные белки (бычий сывороточный альбумин 66 кДа, рекомбинантный апоА-I 33,5 кДа [1], нативный апоА-I 27 кДа [1], лизоцим 14,5 кДа); 2 – лизат клеток инкубированных без добавления индуктора (контроль); 3 – лизат клеток инкубированных с индуктором 0,5 мМ (биомасса для выделения белка); 4 – фракция клеточного дебриса после разрушения ультразвуком; 5 – фракция супернатанта после разрушения ультразвуком; 6 – фракция после прохождения колонки со смолой; 7 – промывочная фракция; 8 – очищенный ферментTEV-протеаза (

29 кДа), фракция, элюированная 250 мМ имидазолом; 10 – фракция, элюированная 250 мМ имидазолом, при выделении фермента из клеток, инкубированных при 20 °С.

Изучение зависимости уровня синтеза фермента от времени инкубации клеток (температура 30 °С) показало, что максимальный уровень экспрессии наблюдается уже через 4 ч (рис. 2, дор. 6), дальнейшая инкубация не приводила к увеличению количества продукта.

Полученные результаты (50 мг/л) в целом совпадают с данными работы [7] для мутанта А26 (54 мг/л), содержащего три аминокислотные замены: T17S, N68D и I77V. Мы предполагали, что наши результаты будут более высокими в сравнении с данными [7], вероятно, отличия объясняются различными экспрессирующими системами, поэтому сравнение результатов является не совсем корректным. Так в работе [7] использовался вектор с промотором Т7, в нашем случае – Т5, а в качестве хозяйского штамма авторы использовали клетки Rosseta(DE3)pLysS, которые синтезируют редкие для E. coli транспортные РНК. Кроме того, авторы в своей работе [7] инкубировали клетки в течение ночи при 20 °С, в нашем же случае инкубация выполнялась 4 часа при 30 °С. Таким образом, достоинством нашей системы можно считать, что аналогичный выход продукта достигался за сравнительно меньший промежуток времени.

Дорожки: 1, 9 – маркерные белки (бычий сывороточный альбумин 66 кДа, рекомбинантный апоА-I 33,5 кДа [1], нативный апоА-I 27 кДа [1], лизоцим 14,5 кДа); 2-7 – лизаты клеток инкубированных с добавлением индуктора в течение 15, 30, 60 мин, 2, 4 и 6 ч соответственно; 8 – очищенный фермент TEV-протеаза.

Мы попытались воспроизвести условия инкубации клеток аналогично работе [7] – снизили температуру инкубации до 20 °С, инкубацию проводили в течение ночи (

20 часов). Однако в результате такого эксперимента, после выделения фермента, в препарате присутствовал полноразмерный полипептид MBP-TEV-протеаза (рис. 1, дор. 10), судя по электрофореграме, примерно половина полипептида оставалось нерасщепленным. Вероятно, это связано с тем, что оптимальная температура для проявления ферментативной активности TEV-протеазы составляет 34 °С [5] и при понижении до 20 °С активность фермента существенно падает, настолько, что в этих условиях полипептид не успевает полностью проводить реакцию саморасщепления. Таким образом, оптимальными условиями для получения фермента в полученных клетках-продуцентах при концентрации индуктора 0,5 мМ являлись: температура инкубации – 30 °С, время инкубации – 4 ч.

Заключение

В результате выполненной работы на основе клеток E. coli шт. BL21(DE3) был получен продуцент рекомбинантного фермента – протеазы вируса табачной мозаики, с выходом белка

50 мг/л. Данный результат был достигнут за счет оптимизации кодонов гена TEV-протеазы для экспрессии в клетках E. coli, слиянием фермента с мальтозо-связывающим белком, и заменой четырех аминокислот (S219V, T17S, N68D и I77V). Оптимальными условиями культивирования клеток-продуцентов были найдены следующие: выращивание клеток до логарифмической фазы роста, добавление индуктора до 0,5 мМ и последующая инкубация клеток 4 ч при 30 °С.

Источник