Что такое первичные метаболиты

Основные функции продуктов метаболизма в организме человека

Роль метаболитов для организма человека

Метаболизм или обмен веществ – это один из важнейших процессов, протекающих в организме живых существ. Его нарушение может привести к ряду проблем, таких как ожирение. Кроме того, неправильный обмен веществ нередко приводит к проявлению аллергических реакций, может стать причиной атопического дерматита у детей и так далее.

Важную роль в описанном процессе играют метаболиты. Собственно, именно благодаря этим веществам обмен веществ и становится возможным. Они бывают:

Метаболиты последней категории в дальнейшем уже не участвуют ни в каких процессах и выводятся из организма вместе с продуктами жизнедеятельности, а именно с мочой, калом, потом и так далее.

Первичные метаболиты

Вещества именно этой группы имеют наибольшее значение, поскольку встречаются во всех без исключения клетках организма и необходимы для нормальной жизнедеятельности. Выделяют четыре категории первичных метаболитов:

Вещества первой категории встречаются в природе чаще любых других биологических молекул. Среди наиболее важных их функций можно выделить транспортировку и хранение необходимой организму энергии. Великолепно справляются с данной задачей гликоген и крахмал. Кроме того, некоторые углеводы, в частности хитин у животных или целлюлоза у растений, выполняют еще и структурную функцию.

Огромное значение для метаболизма имеют белки. Набор задач, которые они выполняют, крайне широк. Одни из них являются катализаторами, то есть ускоряют химические реакции, протекающие в организме. Другие выполняют механическую функцию, кажем, формируя цитоскилет. Плюс к этому, белки отвечают за регуляцию клеточного цикла, иммунных реакций, а также за передачу сигналов через мембраны. Именно поэтому так важно употреблять в пищу достаточное количество белковой пищи, главным образом, мяса. Это поможет вам, кроме всего прочего, бороться с рядом заболеваний, к примеру, вызванных бактерией proteus.

Липиды являются наиболее эффективными источниками энергии в организме. Это объясняется тем, что в них содержится большое количество остатков жирных кислот, которые, в свою очередь, характеризуются крайне низким уровнем окисления. Также липиды выполняют функцию теплоизоляции. Именно поэтому у большинства теплокровных животных основное количество жировой ткани сосредоточено непосредственно под кожными покровами. Фосфолипиды, такие как, холестерин, воск и прочие выполняют структурную функцию, принимая непосредственное участие в построении клеточных мембран и некоторых наружных органов растений.

Из нуклеотидов состоят такие полимерные молекулы, как ДНК и РНК. Основная их функция – это хранение и последующая реализация генетической информации. Нарушения в этих молекулах может привести к очень серьезным заболеваниям и даже мутациям организма. Некоторые вирусы, например, ВИЧ, имеют в своем строении РНК-содержащий геном и благодаря этому могут создавать собственную матрицу ДНК.

В завершение можно сделать, что метаболиты выполняют ряд важнейших функций в жизнедеятельности любого живого организма, в том числе и человека.

Источник

Биотехнология производства метаболитов. Селекция мутантов

» data-shape=»round» data-use-links data-color-scheme=»normal» data-direction=»horizontal» data-services=»messenger,vkontakte,facebook,odnoklassniki,telegram,twitter,viber,whatsapp,moimir,lj,blogger»>

БИОТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА МЕТАБОЛИТОВ

3.1. КЛАССИФИКАЦИЯ ПРОДУКТОВ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ

Спектр продуктов, образующихся методами биотехнологии необычайно широк и разнообразен. Целевыми продуктами био­технологических производств могут быть интактные клетки. Од­ноклеточные организмы используют для получения биомассы являющейся источником кормового белка. Клетки, особенно в иммобилизованном состоянии, выступают в роли биологических катализаторов для процессов биотрансформации.

Процессами биотрансформации называют реакции превращения исходных органических соединений (предшественников) в целе­вой продукт с помощью клеток живых организмов или фермен­тов, выделенных из них. В последние годы высокая специфичность процессов биотрансформации и эффективность иммобилизован­ных ферментов нашли широкое применение для крупномасштаб­ного производства аминокислот, антибиотиков, стероидов и дру­гих промышленно важных продуктов.

Продуктами биотехнологических производств являются природные макромолекулы — белки, ферменты, полисахариды, полиэфиры (поли-(3-гидроксибутират), выделенные из клеток мик­роорганизмов, тканей и органов растений и животных.

По отношению к процессу роста низкомолекулярные продукты метаболизма живых клеток делятся на первичные и вторичные мета­болиты (рис. 3.1). Первичные метаболиты необходимы для роста клеток. К ним относятся структурные единицы биополимеров — аминокислоты, нуклеотиды, моносахариды, а также витамины, коферменты, органические кислоты и другие соединения. Вто­ричные метаболиты (антибиотики, пигменты, токсины) — низ­комолекулярные соединения, не требующиеся для выживания клеток и образующиеся по завершении фазы их роста.

3.2. МЕХАНИЗМЫ ИНТЕНСИФИКАЦИИ ПРОЦЕССОВ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУКТОВ КЛЕТОЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА

Центральное звено биотехнологического процесса — живая клетка, в которой одномоментно синтезируется великое множе­ство разнообразных соединений. В норме обмен веществ в клетке осуществляется по принципам строжайшей экономии, что обес­печивается сложнейшей системой регуляции обмена веществ. За­дача биотехнолога состоит в обеспечении сверхсинтеза одного из продуктов метаболизма, что достигается как путем изменения ге­нетической программы организма, так и посредством нарушения регуляторных систем метаболизма в нем.

Спонтанные изменения генетической природы организма — продуцента основаны на процессах рекомбинации генетического материала in vivo (амплификация, конъюгация, трансдукция, трансформация и пр.). Для выделения из природных популяций высокопродуктивных штаммов микроорганизмов используют ме­тоды селекции, т. е. направленного отбора организмов со скачко­образным изменением геномов. Методы слепого многоступенча­того отбора случайных мутаций чрезвычайно длительны и могут занимать целые годы. Для возникновения мутаций интересующий ген должен удвоиться 10 6 —10 8 раз. Более эффективен метод ис­кусственного повреждения генома. Таким методом является инду­цированный мутагенез, основанный на использовании мутагенно­го действия ряда химических соединений (гидроксиламин, нитрозамины, азотистая кислота, бромурацил, 2-аминопурин, алки- лирующие агенты и др.), рентгеновских и ультрафиолетовых лу­чей. Мутагены вызывают замены и делеции оснований в составе ДНК, а также индуцируют мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания информации.

Несмотря на трудоемкость методов селекции, они не потеряли своего значения для создания высокоэффективных микроорганизмов— продуцентов и оказались перспективными для оценки влия­ния на объекты различных факторов среды — ионов тяжелых ме­таллов, кислот, щелочей и др.

В 1983 г. С.Браун и С.Оливер ис­пользовали методы селекции для отбора мутантных штаммов дрож­жей, устойчивых к высоким концентрациям конечного продукта (Ю %-го этанола), при культивировании их в непрерывном режи­ме (650 ч). Многолетняя селекция штаммов-продуцентов пени­циллина позволила увеличить удельную активность антибиотика культуральной среде в 400 раз, а штаммов бактерий, синтезирующих кобаламин, — в 10 раз. Методами мутагенеза и селекции получены штаммы Eremothecium ashbyii, способные выделять до 1,8 мг рибофлавина в 1 мл среды, и штаммы Brevibacterium ammo- niegenes, продуцирующие до 1 г HSKoA на 1 л среды.

Достижения в области молекулярной биологии и молекулярной генетики позволили биотехнологам начиная с 70-х годов прошед­шего столетия перейти от слепого отбора штаммов мутантов к со­знательному конструированию геномов, используя для этой цели прогрессивную технологию рекомбинантной ДНК.

Каждое из множества разнообразных веществ создается в клет­ке в строго необходимых для роста пропорциях в результате фер­ментативных реакций. Координация химических превращений. обеспечивающая экономность метаболизма, осуществляется у мик­роорганизмов тремя основными механизмами: регуляцией актив­ности ферментов, в том числе путем ретроингибирования; регу­ляцией объема синтеза ферментов (индукция и репрессия био­синтеза ферментов); катаболитной репрессией.

В процессе ретроингибирования (ингибирование по принципобратной связи) активность фермента, стоящего в начале много­ступенчатого превращения субстрата, тормозится конечным ме таболитом, что детально разработано при изучении регуляции био­синтеза пиримидиновых нуклеотидов и новообразования ряда аминокислот:

Таким способом низкомолекулярные метаболиты передают ин­формацию об уровне своей концентрации и состоянии обмена ве­ществ ключевым ферментам метаболизма. Ключевые ферменты — это регуляторы периодичности в процессе функционирования энзи­ма и соответственно образования продукта. Эта ферменты представле- НЬ1 в клетке аллостерическими белками, а конечные метаболиты — тдлостерическими эффекторами (активаторами и ингибиторами) ключевых энзимов. С помощью описанного механизма конечные продукты саморегулируют свой биосинтез. Ретроингибирование — способ точного и быстрого регулирования образования продукта.

На обмен веществ, аналогичный конечным метаболитам, ока­зывают эффект их аналоги (табл. 3.1). Указанное обстоятельство используется для селекции организмов с нарушением механизма обратной связи. Обход механизма ретроингибирования делает объект биотехнологического процесса нечувствительным к кон­центрации конечного продукта.

Таблица 3.1 Аналоги конечных метаболитов

Для отбора объектов продуценты выращивают на селективной среде, содержащей подходящий аналог или антиметаболит, кото­рые не включаются в обмен веществ (в частности, аналоги ами­нокислот не включаются в состав белков), что ведет к подавле­нию роста организма. Выжившие мутанты обладают дефектами в механизме регуляции активности фермента по принципу обрат­ной связи и поэтому служат важными объектами в обеспечении сверхсинтеза целевого продукта.

Среди тысяч энзимов, присущих микроорганизмам, одни, на­пример ферменты гликолиза, синтезируются постоянно и их обра­зование не зависит от состава питательной среды. Такие ферменты называют конститутивными. Другие энзимы, адаптивные или индуцибельные, возникают только в ответ на появление в питательной среде индукторов — субстратов или их структурных аналогов. Так, Добавление (3-галактозида — лактозы к питательной среде, на кото­рой культивируются клетки кишечной палочки Е. coli, вызывает мгновенное появление (3-галактозидазы в них, биосинтез которой в последующий период времени возрастает в 10000 раз. Установ­лено, что регуляция объема биосинтеза ферментов осуществляет­ся на оперонном уровне (Ф.Жакоб и Ж. Моно, 1961) путем изме­нения количества иРНК, образующихся в процессе транскрипции.

Опероном называется упорядоченная совокупность структурных генов (со знаками начала и конца) и регуляторных участков. В состав регуляторной зоны оперона входят ген-регулятор, промо­тор, усилители транскрипции (энхансеры), ослабители транскрип­ции (сайлансеры) и другие компоненты.

В процессе индукции низкомолекулярный метаболит-индуктор (например, лактоза), соединяясь с репрессорным белком (про­дукт гена-регулятора), инактивирует его и тем самым препятству­ет взаимодействию белка-репрессора с зоной оператора, что обес­печивает возможность присоединения к промотору РНК-полимеразы и начало синтеза иРНК.

Изучение механизма регуляции новообразования аминокислот у микроорганизмов показало, что конечные продукты метаболичес­ких путей не только ингибируют активность ферментов первых ста­дий процесса, но и тормозят биосинтез ферментов последних его этапов. Таким образом, помимо аминокислот у микроорганизмов регулируется новообразование многих первичных метаболитов (пури- новых и пиримидиновых нуклеотидов, витаминов и других соедине­ний). Обнаруженный феномен был назван репрессией, а ферменты, биосинтез которых стопорится под влиянием низкомолекулярных метаболитов, переводящих репрессорный белок в активную фор­му, способную оккупировать зону первоначального связывания РНК-полимеразы (оператор), называются репрессибельными. К их числу относятся глутаминсинтетаза, триптофансинтетаза, орнитин- карбамилтрансфераза, уреаза и ряд других энзимов. Специально поставленные опыты продемонстрировали, что репрессия биосин­теза ферментов обеспечивает более грубую в сравнении с ретро- ингибированием регуляцию образования анаболических энзимов Если концентрация конечного продукта уменьшается до опреде­ленного очень низкого уровня, то происходит дерепрессия фермен­та, т. е. скорость их биосинтеза возрастает до необходимых величин Бактериальные клетки продуцируют множество низкомолеку­лярных эффекторов в ответ на изменение окружающей средь: (стресс, голодание, действие фагов и пр.). Каждый из эффекто­ров, взаимодействуя по аллостерическому механизму с опреде­ленными регуляторными белками, моделирует промоторную спе­цифичность РНК-полимеразы, запуская тем самым экспрессию определенного набора генов.

Таким образом, ведущими механизмами, обеспечивающим! экономность образования продуктов в клетках микроорганизмоь являются ретроингибирование и репрессия, базирующиеся н принципе обратной связи.

Если в питательной среде присутствуют несколько различны источников углерода, клетка микроорганизма вырабатывает ферменты для усвоения лишь одного, наиболее предпочтительного суб­страта.

Так, когда клетки выращивают на смеси глюкозы и лакто­зы, то в первую очередь утилизируется глюкоза. После полного ис­черпания глюкозы происходит экспрессия ферментов метаболизма лактозы (экспрессия структурных генов лактозного оперона). Это явление получило название катаболитной репрессии, так как ранее полагали, что причина его состоит в подавлении биосинтеза фер­ментов обмена лактозы продуктами катаболизма глюкозы.

Следовательно, сущность катаболитной репрессии заключает­ся в подавлении биосинтеза ферментов, обеспечивающих метабо­лизм одного источника углерода другим источником углерода.

Лактозный оперон (lac-оперон) включает структурные гены трех ферментов: X, Y и А (отвечают за взаимозависимый синтез (3-галактозидазы, галактозилпермеазы и ацетилтрансферазы), кон­тролирующих метаболизм лактозы в клетке (рис. 3.2). Экспрессия ферментов регулируется белком-репрессором — продуктом гена- регулятора (R), пространственно удаленного от гена-оператора (О). Субъединицы репрессора (38кДах4) возникают с постоян­ной скоростью. Репрессор обладает высоким сродством к соответ-: ствующему оператору (К = 1(Г 12 моль/л). Именно белок-репрес-, сор, будучи присоединен к гену-оператору, препятствует транс­крипции структурных генов X, Y и А.

Установлено, что катаболитная репрессия опосредуется дей­ствием специального белка-активатора катаболитных генов (БАК). Об отсутствии глюкозы в среде сигнализирует цАМФ. Лишь при дефиците глюкозы формируется комплекс цАМФ и БАК, абсо­лютно необходимый для связывания РНК-полимеразы с зоной промотора и начала транскрипции генов. В присутствии глюкозы концентрация цАМФ недостаточна для образования комплекса. Уровень цАМФ в клетке является функцией активности адени- латциклазы, синтез которой подавляется в присутствии глюкозы:

3.3. МЕТОДОЛОГИЯ СЕЛЕКЦИИ МУТАНТОВ С ДЕФЕКТАМИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И РЕГУЛЯЦИИ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ

Уровень экспрессии структурных генов в той или иной степени может быть изменен в результате мутаций, осуществляемых по раз­личным участкам оперона. Целенаправленная селекция перспектив­ных мутантов для создания высокопродуктивных организмов — важ­нейшая задача биотехнологии, ибо лишь дефекты регуляции обмена веществ обеспечивают синтез целевых продуктов метаболизма.

Так, мутации по участкам цистрона, детерминирующим струк­туру аллостерического центра фермента, могут привести к изме­нениям в конформации белка, которые делают молекулу энзима нечувствительной к концентрации конечного продукта. Это обес­печивает возможность образования в клетке избыточного количе­ства целевого продукта.

Мутации в гене-регуляторе проводят таким образом, чтобы его продукт — белок-репрессор — утрачивал способность связываться либо с индуктором, либо с оператором. В результате мутаций исчезает эффект катаболитной экспрессии, а индупибельные фермен­ты становятся конститутивными, т.е. их экспрессия не зависит от присутствия в среде субстрата. Мутантные организмы, у которых изменены нуклеотидные последовательности в зоне гена-операто­ра, не могут связывать нормальный репрессор и также приобрета­ют способность к конститутивной экспрессии структурных генов.

Мутанты с дефектами регуляторной области оперона называ­ются регуляторными, их функция — биосинтез конститутивных ферментов.

Выключение механизма ретроингибирования возможно, если мутации у микроорганизмов вызывают дефект (разрыв) в последо­вательности биохимических реакций образования конечного про­дукта. Из-за отсутствия или выключения фермента (Ф), катализи­рующего промежуточную стадию процесса, в среде накапливает­ся не конечный продукт, а промежуточный целевой метаболит.

Мутанты с ограниченной способностью к образованию конеч­ных продуктов называются ауксотрофными. Благодаря отсутствию ингибитора (конечного продукта) использование субстрата и рост микроорганизма продолжаются, но лишь при условии добавле­ния в среду в лимитирующих количествах вещества — продукта блокированной реакции:

На практике высокопродуктивные организмы часто обладают двумя видами мутаций и являются ауксотрофно-регуляторными мутантами.

Для отбора мутантов с дефектами экспрессии генов и регуля­ции обмена веществ используют эффективные методы селекции. Один из них состоит в получении мутантов, устойчивых к структур­ным аналогам целевого продукта (см. с. 35). В основе другого метода лежит выделение ревертантов из ауксотрофных мутантов. У таких мутантов восстановлена способность к синтезу конечного продукта, однако механизм ретроингибирования у них не функционирует вследствие изменения пространственной структуры ключевого фер­мента.

Знание механизмов регуляции обмена веществ в клетке необ­ходимо для сознательного управления процессами биосинтеза це­левых продуктов и создания организмов-сверхпродуцентов. В пос­ледующих разделах эти положения будут проиллюстрированы на примере рассмотрения технологии получения конкретных соеди­нений.

Источник

Микробиомные исследования с применением знаний метаболомики

Микробиом и метаболом

Микробиомные исследования с применением знаний метаболомики

СОДЕРЖАНИЕ:

Кратко о метаболомике и метаболоме

Метаболом представляет собой полный набор низкомолекулярных метаболитов (таких как промежуточные продукты обмена веществ, гормоны и другие сигнальные молекулы и вторичные метаболиты), которые могут быть найдены как в биологическом образце, так и в единичном организме. В человеческом теле по данным 2007 г. найдены около 2500 метаболитов, 1200 лекарств и 3500 компонентов пищи, которые в настоящее время каталогизированы (и постоянно пополняются) в доступной базе метаболома человека ( www.hmdb.c a ).

Комплексный взгляд на Метагеномы и Метаболомы кишечных заболеваний

Резюме. В последнее время метагеномика и метаболомика являются двумя наиболее быстро развивающимися “омическими” технологиями. Метагеномика стремится охарактеризовать состав микробных сообществ, их функционирование и динамично развивающиеся взаимоотношения с занимаемыми ими средами обитания, в то время как метаболомика изучает уникальные химические конечные точки (метаболиты), которые оставляют после себя специфические клеточные процессы. Значительный прогресс в технологии секвенирования ДНК и масс-спектрометрии позволил провести всесторонний сбор информации о микробиоме кишечника и его метаболоме с целью оценки влияния микробиоты кишечника на физиологию хозяина на уровне целостных систем. Наша кишечная микробиота, состоящая из прокариотических клеток вместе с их метаболитами, создает уникальную кишечную экосистему вместе с эукариотическими клетками-хозяевами. В этом обзоре мы рассмотрим детальную взаимосвязь между микробиотой кишечника и ее метаболитами в отношении здоровья хозяина и патогенезом различных кишечных заболеваний, таких как воспалительные заболевания кишечника и колоректальный рак. Также будут обсуждаться терапевтические вмешательства, такие как введение пробиотиков и пребиотиков, а также трансплантация фекальной микробиоты. Мы хотели бы продвигать этот уникальный общебиологический подход к включению информации о метагеномах и метаболомах, поскольку мы считаем, что это может помочь нам в большей степени понять сложное взаимодействие между кишечной микробиотой и метаболизмом хозяина. Эта новая интеграция информации о микробиоме, метатранскриптоме и метаболоме поможет нам улучшить целостное понимание сложного суперорганизма млекопитающих, тем самым позволив нам получить новые и беспрецедентные идеи для обеспечения захватывающих новых терапевтических подходов для оптимального здоровья кишечника.

1. Кишечная микробиота

Микробиота кишечника относится ко всем микроорганизмам, населяющим желудочно-кишечный тракт. У млекопитающих в кишечной микробиоте преобладают Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes и Proteobacteria, и, как сообщается, эти типы играют важную роль в формировании метаболизма и физиологии хозяина [1]. Общее количество бактерий, населяющих кишечник, составляет около 100 триллионов клеток, что примерно в три раза превышает общее количество клеток в организме человека [2]. Таким образом, кишечная микробиота часто считается функциональным и измеримым органом, состоящим из прокариотических клеток с эукариотическими клетками-хозяевами, сливающимися вместе для создания уникальной кишечной экосистемы [3]. В соответствии с диетическим образом жизни и состоянием питания хозяина, кишечные микробиоты различаются по составу вдоль пищеварительного тракта и эволюционируют внутри и между индивидуумами с течением времени [4]. Только в последние годы мы начали понимать системное влияние кишечной микробиоты на весь метаболический репертуар организма. В дополнение к очевидной роли кишечной микробиоты в пищеварении, она играет роль не только в поддержании оптимального здоровья хозяина, но и в этиопатогенезе различных метаболических заболеваний, таких как ожирение [5,6,7], диабет [1,8, 9]; кишечные заболевания, такие как воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) [10], колоректальный рак (CRC) [11]; и такие заболевания, как аллергия [12], рассеянный склероз [13], хроническое заболевание почек [9], атеросклероз [14,15] и аутизм [16].

2. Что такое метаболомика?

Технологические достижения позволили провести комплексную оценку тысяч генов (геномика), транскриптов (транскриптомика), белков (протеомика), метаболитов (метаболомика) и кишечной микробиоты (метагеномика) с помощью высокопроизводительных методов и аналитических инструментов [17]. Быстрый прогресс в технологиях секвенирования ДНК и масс-спектрометрии (МС) в последние годы позволил провести обширный сбор данных о кишечном микробиоме и метаболоме для всесторонней оценки влияния кишечной микробиоты на здоровье человека [18]. Поскольку целостное понимание метаболизма органов и систем жизненно важно для поддержания здоровья и состояния питания [19], это привело к значительному прогрессу в технологиях метагенома и метаболома, что позволило нам лучше понять роль кишечной микробиоты в влиянии на общее состояние здоровья хозяина.

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и масс-спектрометрия (МС) являются двумя наиболее широко используемыми метаболомно-аналитическими методами широкого спектра действия для идентификации биомаркеров заболевания. Используя эти подходы, мы можем точно идентифицировать и иметь четкое представление о метаболитах, продуцируемых микробиотой и клетками-хозяевами в образцах фекалий, крови, тканей и мочи [20]. Эти инструменты позволяют ученым понять степень воздействия обработок на метаболический профиль хозяина путем одновременного анализа присутствия и количества тысяч метаболитов.

3. Использование Метаболомики для понимания микробиоты кишечника

В настоящее время оценка метаболического профиля обычно используется для прямого сравнения метаболизма кишечной микробиоты и возможных метаболических исходов в организме хозяина. В докладе, исследующем системное влияние введения пробиотиков или пребиотиков или комбинации того и другого у первоначально свободных от микробов мышей, колонизированных комбинацией микробов, представляющих собой кишечную микробиоту человеческого младенца [21], было обнаружено, что пробиотическое / пребиотическое вмешательство значительно изменяет относительный состав сообщества кишечной микробиоты, приводя к системным изменениям в метаболических профилях различных тканей. В группах, получавших пребиотики, наблюдалось увеличение доли Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum и Bacteroides distasonis; снижение доли Escherichia coli и Clostridium perfringens; а также модуляция липидного обмена за счет снижения концентрации глюкозы и печеночных триглицеридов в плазме крови [21]. В другом докладе Wikoff et al. (2009), влияние микробиоты кишечника на хозяина оценивали у безмикробных и условно выращенных мышей путем сравнения профилей метаболома плазмы. Было много метаболитов, которые были обнаружены только у условно выращенных мышей, а не у мышей без микробов. Кроме того, концентрации более чем одной десятой всех метаболитов различались более чем на 50% при сравнении условно выращенных мышей и мышей без микробов [22].

4. Взаимосвязь между кишечной экосистемой, колоректальным раком и воспалительным заболеванием кишечника.

Как мы уже сообщали ранее, интеграция между активностью микробиома кишечника и нашими генами отражает общий метаболизм человека на системном уровне [23]. Наш желудочно-кишечный тракт обеспечивает питательные вещества для клеток и тканей через систему кровообращения, а также метаболиты, происходящие из кишечной микробиоты. Это тонкое взаимодействие между метаболитами, происходящими из кишечной микробиоты, самой микробиотой кишечника и иммунной системой хозяина передается через широкий спектр сигнальных путей, которые простираются за пределы иммунной системы. Прямые химические взаимодействия между кишечной микробиотой и хозяином и иммунно-опосредованные сигнальные механизмы влияют на различные органы, такие как кишечник, печень, скелетная мускулатура и мозг, и эти сложные взаимосвязи взаимно объединяются, чтобы достичь кульминации в ряде метаболических осей хозяин-микроб. В пределах этих осей метаболические реакции могут регулироваться кишечными микробными геномами, что приводит к выработке холина, фенолов, желчных кислот и короткоцепочечных жирных кислот (SCFAs) как кишечным микробиомом, так и геномом хозяина, которые необходимы для здоровья хозяина [23] (рис. 1). В этом обзоре мы обсудим взаимосвязь между метаболизмом кишечной микробиоты и защитными и вредными метаболитами в патогенезе колоректального рака (CRC) и ВЗК. Кроме того, мы также кратко обсудим терапевтические вмешательства, такие как введение пробиотика или пребиотика и трансплантация фекальной микробиоты (FMT).

Рисунок 1. Наша сложная кишечная экосистема включает четыре бактериальных типа: Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria и Proteobacteria, которые доминируют в кишечной микробиоте у млекопитающих, и, как сообщалось, характеризуют роль метаболизма и физиологии хозяина. В зависимости от пищевого образа жизни хозяина кишечная микробиота и ее метаболиты, такие как N-нитрозосоединения (NOCs), аммиак, полиамин, таурин, желчные кислоты, сероводород и короткоцепочечные жирные кислоты (SCFAs), в значительной степени вовлечены в этиопатогенез метаболических заболеваний, кишечных заболеваний и внекишечных заболеваний, тем самым играя жизненно важную роль в здоровье хозяина.

5. Колоректальный рак

CRC занимает третье место в мире по смертности от рака. Механизм патогенеза CRC известен как последовательность аденома-карцинома [24], где генетические изменения приводят к переходу от нормальной слизистой оболочки к предраковым поражениям, а затем к колоректальным аденомам и фульминантным CRC в течение многих лет [25]. Хотя некоторые причины CRC являются наследственными, большинство случаев CRC можно отнести к диете и образу жизни [26]. Однако недавнее исследование показало, что прогрессирование рака, связанное с питанием, связано со значительными сдвигами в кишечных микробных сообществах в результате взаимодействия хозяина и окружающей среды независимо от ожирения, и что онкогенез может передаваться среди генетически предрасположенных людей [27]. Кроме того, люди с ВЗК имеют повышенную частоту CRC, и это известно как колит-ассоциированный рак [28,29]. Также сообщалось, что само воспаление изменяет физиологию хозяина, тем самым способствуя раку, как это видно на мышиной модели CRC, ассоциированной с колитом, где колит изменяет микробный состав и индуцирует приращение генотоксических микроорганизмов [30]. Хотя существует много сообщений, в которых рассматривается потенциальная роль определенных штаммов патогенных бактерий в продвижении CRC посредством провоспалительных взаимодействий с клетками-хозяевами [25,29,31], становится все более очевидным, что совокупная активность кишечной микробиоты и их продукты метаболизма значительно влияют на патогенез и защиту от CRC [25,27,29,31,32].

См. дополнительно :

6. Воспалительное заболевание кишечника

ВЗК представляет собой группу изнурительных воспалительных заболеваний, поражающих желудочно-кишечный тракт. Два основных типа включают болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК). Ни один из них не смертелен; однако у больных пациентов наблюдается большое разнообразие симптомов, связанных с воспалением кишечника, от боли в животе, лихорадки, рвоты, диареи, ректального кровотечения и анемии до потери веса. Симптомы обычно устраняются с помощью противовоспалительных стероидов или иммунодепрессантов для уменьшения воспаления. Диетические или жизненные вмешательства также используются, чтобы попытаться устранить триггеры окружающей среды. В тяжелых случаях ВЗК требуется операция по удалению поврежденных участков кишечника [33]. Распространенность ВЗК в настоящее время самая высокая в Европе и Северной Америке [10]. Глобальная распространенность ВЗК растет, при этом наблюдается быстрый рост заболеваемости по мере того, как все больше стран переходят на «западный» образ жизни [34]. Показатели заболеваемости также возрастают у молодых людей, что увеличивает нагрузку на ресурсы здравоохранения (особенно в связи с тем, что раннее ВЗК связано с более высоким риском развития CRC) [35]. Общегеномное исследование ассоциации в 2008 году сообщило о 30 значительных генах восприимчивости и локусах для частоты возникновения БК и патогенеза [36]. Оценка последовательности 16S рРНК желудочно-кишечного содержимого у пациентов с БК и ЯК выявила аномальный состав микробиоты кишечника, характеризующийся истощением комменсальных Firmicutes и Bacteroidetes [37] и снижением количества Faecalibacterium prausnitzii, основного члена Firmicutes, который, как сообщалось, также ассоциирован с БК [38]. Хотя были многочисленные сообщения об уменьшении разнообразия кишечных микробных популяций, которые наблюдаются у пациентов с БК и ЯК [23,37,38], недавний отчет показал, что существуют аномальные кишечные виромы, где наблюдается значительное расширение бактериофагов Caudovirales у пациентов с ВЗК. Интересно, что виромы пациентов с БК и ЯК были специфичны для заболевания и когорты, а разнообразие кишечного кишечника не было вторичным по отношению к изменениям в кишечном микробном сообществе. Эти данные подтверждают модель, в которой изменения в вироме могут способствовать воспалению кишечника и бактериальному дисбиозу, что позволяет предположить, являются ли изменения бактериального микробиома при ВЗК вторичными по отношению к изменениям в появлении бактериофагов или введении бактериофагов после вмешательств в образ жизни [39]. В целом, ВЗК представляет собой серьезное бремя для здоровья в мире, которое вызывает растущую обеспокоенность.

См. дополнительно:

7. Микробный метаболизм в кишечнике

Как правило, анаэробное микробное сообщество кишечника ферментирует непереваренные пищевые компоненты, которые достигают толстого кишечника в большой спектр метаболитов. Это иллюстрирует как удивительную биохимическую емкость кишечной микробиоты, так и большое разнообразие доступных субстратов [40]. Основные продукты ферментации у здоровых людей включают газы и органические кислоты, главным образом три короткоцепочечные жирные кислоты (SCFAs): ацетат, пропионат и бутират. Эти SCFAs часто имеют соотношение 3: 1: 1 и имеют общую концентрацию 50–150 мМ в толстой кишке [41]. Неперевариваемые углеводы, включающие некрахмальные полисахариды (структурные полисахариды клеточных стенок растений), резистентный крахмал и некоторые растворимые олигосахариды (фруктоолигосахариды), обычно являются первичными субстратами для микробного брожения [42].

Метаболизм кишечной микробиоты также может включать анаэробное дыхание, в котором в качестве акцепторов электронов выступают нитрат, сульфат и некоторые органические соединения [43]. Факультативные анаэробы, такие как Proteobacteria, могут использовать доступный кислород в качестве акцептора электронов, что увеличивает их рекуперацию энергии из субстратов по сравнению с большинством облигатных анаэробов, за исключением Bacteroides spp. и Faecalibacterium prausnitzii. Бактерии Bacteroides spp. имеют цитохромы, в то время как F. prausnitzii зависят от внеклеточного переноса электронов через флавины и тиолы [44,45]. Кишечные микробы, которые используют водород и формиат, включая ацетогенные бактерии (например, Blautia hydroydrophica), метаногенные археи (Methanobrevibacter smithii) и сульфатредуцирующие бактерии (например, Desulfovibrio spp.), играют жизненно важную роль в анаэробном метаболизме через межвидовые взаимодействия перекрестного питания [46]. Относительный вклад ацетогенеза, метаногенеза и восстановления сульфатов метаногенными археями зависит от численности этих бактерий и изменения времени прохождения кишечника [47].

8. Защитные и вредные метаболиты

В этом обзоре микробные метаболиты кишечника и ферментативная активность будут разделены на разделы в зависимости от того, предполагается ли, что они являются защитными или оказывают неблагоприятное воздействие на здоровье кишечника, воспаление и канцерогенез.

9. Влияние SCFA на клетки-хозяева

Внеклеточные SCFAs участвуют в нескольких важных взаимодействиях с поверхностно-экспонированными рецепторами клеток-хозяев: G-белок-связанным рецептором 41 (GPR41), GPR43 и GPR109A [48,61,62]. GPR43 распознает все три основных SCFAs. Сродство к GPR41 находится в следующем порядке: пропионат> бутират >> ацетат. С другой стороны, GPR109A взаимодействует только с бутиратом [62]. Противовоспалительная бутират-управляемая передача сигналов, которая включает GPR109A, способствует дифференцировке Treg-клеток и IL-10-продуцирующих T-клеток, блокируя активацию ядерного фактора-kB (NF-kB), а также индуцируя апоптоз через механизм, независимый от ингибирования HDAC [62,63]. Ацетат и пропионат связываются с GPR43, тем самым оказывая противовоспалительное действие посредством модулирования клеток Treg [52,64]. Таким образом, противоопухолевые эффекты пропионата и бутирата, которые связаны с высоким потреблением клетчатки, могут быть опосредованы через подавляющие опухоль гены GPR43 и GPR109A [65]. Другие сообщения об антиканцерогенных эффектах бутирата включают ингибирование пролиферации и селективную индукцию апоптоза клеток CRC [49,51,66,67]. Эффект подавления рака еще полностью не выяснен; однако ингибирование HDAC может быть фактором, приводящим к изменениям регуляции транскрипции [50]. Сообщалось, что в результате ингибирования HDAC бутират и, в меньшей степени, пропионат активируют сигнальный путь AP-1 в эпителиальных клеточных линиях, которые играют жизненно важную роль в контроле клеточной пролиферации и апоптоза [68]. Несмотря на сообщения о противораковых свойствах бутирата, в последние годы исследование с использованием мышиной модели CRC показало, что низкие концентрации бутирата могут способствовать патогенезу CRC путем стимуляции роста эпителиальных клеток толстой кишки [27].

10. Вредные метаболиты: продукты белковой ферментации.

Большое количество потребляемого белка приводит к увеличению ферментации белка, получаемого из рациона, в толстой кишке, где могут наблюдаться повышенные концентрации продуктов, происходящих из аминокислот, таких как жирные кислоты с разветвленной цепью и фенилуксусная кислота [69,70,71]. Подмножество кишечной микробиоты, включая несколько субстратов бактероидов (Bacteroides spp.) и некоторых фирмикутов (Firmicutes), ферментирует аминокислоты с целью получения потенциально биологически активных соединений, таких как фенилуксусная кислота, фенолы, индолы и п-крезол [72]. Некоторые азотистые соединения, в частности N-нитрозосоединения (NOCs), обладают способностью стимулировать патогенез рака и оказывать канцерогенное действие посредством алкилирования ДНК, что может привести к мутациям. Потребление диетических NOCs положительно коррелирует с заболеваемостью CRC у европейцев [73]; тем не менее, NOCs также могут образовываться эндогенно посредством кислотного нитрозирования в желудке и нитрозирования аминов, полученных в результате микробной ферментации белка в толстой кишке [74]. Повышенные концентрации фекальных NOCs наблюдались у людей, которые потребляют высокобелковые диеты в контролируемых исследованиях диетического вмешательства [70]. Нитроредуктазы и нитратредуктазы, которые кодируются протеобактериями (Proteobacteria), также способствуют реакциям нитрозирования. Сообщалось, что аммиак, продукт ферментации белка, является потенциальным канцерогенным агентом, поскольку относительно низкие концентрации вызывают увеличение повреждения слизистой оболочки и аденокарциномы толстой кишки на мышиной модели [71,74]. Полиамины, такие как путресцин, спермидин и спермин, участвуют в широком спектре важнейших физиологических функций, таких как поддержание структурной целостности мембран, регуляция и трансляция генов [75,76]. Основные вышеупомянутые полиамины вырабатываются из аргинина в тканях хозяина, но синтез полиаминов также может происходить в кишечной микробиоте [77,78,79]. Сообщается, что высокий уровень полиаминов токсичен и связан с множеством заболеваний, включая рак. Окислительный стресс, вызванный катаболизмом полиаминов, считается фактором, способствующим токсичности [76]. Некоторые кишечные бактерии, такие как Bacteroides fragilis, усиливают выработку полиамина клетками-хозяевами, помимо того, что вносят непосредственный вклад в пул полиаминов путем синтеза таких соединений. Некоторые патогены, такие как Shigella flexneri, Streptococcus pneumonia, Salmonella enterica subsp и Helicobacter pylori, используют полиамины для повышения своей вирулентности [75].

11. Вредные метаболиты: метаболизм желчных кислот

12. Вредные метаболиты: сероводород

В кишечнике сероводород вырабатывается путем снижения содержания сульфата в рационе и метаболизма таких соединений, как серосодержащие аминокислоты [85] и таурин [88]. Сульфатредуцирующие бактерии, связанные с Desulfovibrio spp., хотя обнаруживаются в небольшом количестве у большинства особей, способны использовать лактат в качестве субстрата для роста и в то же время образуют сульфид [88]. Сульфид токсичен для колоноцитов и ингибирует окисление бутирата, тем самым приводя к разрушению барьера колоноцитов, способствуя патогенезу ЯК [89]. Он также может повредить ДНК в нетрансформированных клеточных линиях человека в концентрациях, аналогично обнаруженных в просвете толстой кишки (0,25–2 мМ) [89], и предполагается, что активные формы кислорода участвуют в этой генотоксичности [90].

13. Терапевтические вмешательства при заболеваниях кишечника

13.1. Пробиотические вмешательства

Пробиотики определяются как «живые микроорганизмы» и при назначении в соответствующих количествах оказывают благотворное влияние на здоровье хозяина [91]. Сообщалось, что определенные бактериальные штаммы играют защитную роль против ВЗК, конкурируя с патогенными микробами или непосредственно предотвращая колонизацию в кишечнике, а также благодаря их противовоспалительным свойствам [92].

Непатогенная кишечная палочка, E. coli Nissle 1917, является наиболее изученным одноштаммовым пробиотиком. Сообщалось, что он так же эффективен и безопасен, как и мезалазин, в поддержании ремиссии у пациентов с ЯК [93]. Кроме того, ректальное введение E. coli Nissle 1917, как сообщается, было значительно более эффективным, чем плацебо, в индуцировании ремиссии у дистальных пациентов с легкой и умеренной активностью ЯК [94]. Lactobacillus rhamnosus GG также сравнивали с мезалазином для поддержания ремиссии ЯК. Хотя аналогичные частоты рецидивов после 6–12 месяцев лечения наблюдались при обоих методах лечения, у L. rhamnosus GG было получено значительно более длительное время без рецидивов [95]. L. rhamnosus GG также использовали в качестве дополнения к традиционной терапии для поддержания индукции и ремиссии БК. Однако никаких существенных положительных эффектов по сравнению с плацебо не наблюдалось. В исследовании на животных, когда ферментированное молоко, содержащее B. lactis, L. lactis, S. thermophilus и L. bulgaricus, вводили колитическим мышам, наблюдалось улучшение воспаления. Также наблюдалось увеличение количества бактерий, продуцирующих бутират, и сопутствующее уменьшение штаммов энтеробактерий Klebsiella pneumoniae и Proteus mirabilis, способных вызывать воспаление толстой кишки [96]. Когда мышей, ассоциированных с микробиотой человека, лечили пробиотиками Lactobacillus paracasei или Lactobacillus rhamnosus и двумя галактозил-олигосахаридными пребиотиками, количество Bifidobacterium longum и Bifidobacterium breve увеличивалось, тогда как количество Clostridium perfringens было снижено. Это ремоделирование состава кишечной микробиоты привело к изменениям в различных метаболических путях хозяина, таких как глюконеогенез, липидный профиль и метаболизм аминокислот [97]. Конъюгированная линолевая кислота является естественным изомером линолевой кислоты, обнаруженным в мясе и молочных продуктах жвачных животных [98], и, как сообщалось, защищает от канцерогенеза толстой кишки, атеросклероза и ожирения у мышей [99,100]. В недавнем исследовании, где Bifidobacterium longum BB536 (BB536) вводили гнотобиотическим мышам, содержащим 15 штаммов преобладающей кишечной микробиоты человека, было отмечено, что в группе BB536 наблюдалось значительное увеличение фекальных уровней предшественника биотина-пимелата, бутирата и биотина. Увеличение концентрации биотина можно объяснить изменениями в метаболизме, связанными с синтезом биотина Bacteroides caccae у мышей. Доля бутират-продуцирующей микробиоты, Eubacterium rectale, была значительно выше в группе BB536, чем в группе без него [101].

13.2. Пребиотические вмешательства

Пребиотики представляют собой неперевариваемые соединения, которые придают специфические изменения в составе и активности микробиоты кишечника, тем самым оказывая благотворное влияние на здоровье хозяина [97]. Проросшие пищевые продукты из ячменя (GBF), которые часто изучаются при поддержании ВЗК, являются пребиотиками, богатыми глютамином и гемицеллюлозой [102]. Диетическое вмешательство GBF привело к увеличению продукции SCFAs на мышиной модели и снижению дефекации, а также уменьшению повреждения толстой кишки и фекальной крови [102,103]. В небольших клинических исследованиях с умеренно активными пациентами с ЯК применение GBF в качестве дополнения к традиционной терапии также показало значительное улучшение показателей клинической активности. У этих пациентов также сообщалось об увеличении содержания фекального бутирата [104]. Кроме того, при использовании диетических вмешательствах у пациентов с неактивным ЯК для поддержания ремиссии, у пациентов, подвергшихся GBF, частота рецидивов была значительно ниже, чем у пациентов, получавших только традиционную терапию, что сопровождалось очевидным снижением сывороточных провоспалительных цитокинов IL-6 и IL-8 [105]. В недавнем плацебо-контролируемом клиническом испытании с активными или спокойными субъектами с БК легкой и средней степени тяжести вмешательство инулина, обогащенного олигофруктозой, в течение четырех недель было эффективным для снижения активности заболевания и изменения состава микробиоты кишечника путем увеличения числа штаммов B. longum. [106]. Существует множество модельных исследований на животных с использованием пребиотических кормовых добавок, которые показали значительное влияние на профилактику и лечение CRC. Питание длинноцепочечными фруктанами типа инулина усиливает бифидогенные эффекты, снижает рН, модулирует иммунитет и снижает количество индуцированных азоксиметаном ( АОМ ) предопухолевых аберрантных криптовых очагов толстой кишки ( ACF ), а также опухолей тонкого кишечника и толстой кишки в модели CRC мышей [107]. Вмешательство ксилолигосахаридов и фруктоолигосахаридов ингибировало ACF толстой кишки у крыс, получавших диметилгиразин, снижая рН слепой кишки и уровень триглицеридов в сыворотке крови. Это вмешательство также привело к увеличению общей массы слепой кишки, увеличению популяции бифидобактерий и значительному снижению ACF толстой кишки [108].

13.3. Трансплантация фекальной микробиоты ( FMT)

Рисунок 2. Дисбактериозные воспалительные заболевания кишечника и колоректальный рак и соответствующие терапевтические вмешательства. Дисбактериоз относится к дисбалансу между миротворческими бактериями и патобионтами, что приводит к кишечным заболеваниям, таким как воспалительные заболевания кишечника и колоректальный рак. Некоторые бактериальные метаболиты могут вызывать прямое повреждение ДНК или способствовать воспалению. Патобионты также оказывают провоспалительное действие. Кроме того, потеря барьерной функции приведет к увеличению бактериальной транслокации, что приведет к дальнейшему развитию провоспалительных путей, что приведет к онкогенезу. Сообщалось, что прием пробиотиков и / или пребиотиков и трансплантация фекальной микробиоты восстанавливают симбиоз.

14. Выводы

Исследования, которые мы рассмотрели здесь, подчеркивают, что патогенез кишечных заболеваний, таких как ВЗК и CRC, зависит не только от конкретных патогенов, но и от метаболического выхода кишечной микробиоты. Тем не менее, мы все еще начинаем всесторонне понимать взаимосвязь между защитными и вредными метаболитами, их пути разложения в кишечнике вследствие кишечной микробиоты и последующее воздействие на здоровье хозяина. Поэтому, в свете этого, мы решительно выступаем за интеграцию метагеномной и метаболомной информации, поскольку считаем, что это ценная методология, которая позволила бы нам глубже понять эту сложную взаимосвязь между кишечной микробиотой и метаболическим потоком хозяина. Кроме того, интеграция информации, полученной из микробиомных, метатранскриптомных и метаболомных платформ, также приведет к улучшению всестороннего понимания сложного суперорганизма млекопитающих. Огромное количество ценных данных, полученных на основе этого мульти-омического понимания метаболических взаимодействий между образом жизни, питательными интервенциями и экосистемой кишечника, обеспечит интригующие новые терапевтические возможности не только в профилактике и поддержании ремиссии CRC и ВЗК, но и в внесении жизненно важного вклада в поддержание и продвижение оптимального здоровья хозяина для повышения качества жизни каждого человека.

Литература к подразделу II →

Применение Метаболомики к пробиотическим и пребиотическим вмешательствам в клинических исследованиях на людях

1. Вступление

В начале 1990-х годов, с развитием методов секвенирования нуклеиновых кислот, интерес к микробиому вновь возрос. Новые методы, включающие анализ рибосомных малых субъединиц РНК-генов, например 16S-рибосомный анализ генов, быстро нашли свое применение в изучении кишечной среды. Вычислительные методы позволили определить микробное сообщество с беспрецедентным уровнем детализации. Однако, помимо состава, следует признать, что значительная часть воздействия бактериального сообщества на хозяина передается через производимые им метаболиты. Микробы производят или трансформируют широкий спектр циркулирующих химических веществ, включая аминокислоты, жирные кислоты, желчные кислоты, гормоны и витамины [4,5].

Связь между составом микробного сообщества и метаболической активностью является косвенной и, как было показано, сильно зависит от функциональной избыточности и метаболической пластичности [6,7,8]. Функциональная избыточность указывает на то, что некоторые виды могут быть взаимозаменяемы, выполняя при этом сходные функции. Таким образом, различия в микробных сообществах могут не приводить к различиям в функциях. Метаболическая пластичность отражает способность данного сообщества адаптироваться к изменениям окружающей среды путем корректировки метаболического функционирования. Для того чтобы лучше понять, каким образом пробиотические и пребиотические вмешательства влияют на хозяина, анализ микробного сообщества должен также сопровождаться анализом функции этих сообществ путем изучения метаболома.

Конечная цель многих исследований в области пробиотиков и пребиотиков состоит в том, чтобы помочь в разработке более эффективных и персонализированных вмешательств для улучшения здоровья человека. К сожалению, изысканный уровень контроля, доступный в исследованиях на животных, включая строго контролируемые диеты и окружающую среду, строго определенные графики дозирования пробиотиков и пребиотиков, а также возможность инвазивного отбора проб у человека отсутствуют (недоступны). Целью данного обзора является оценка современного состояния науки при анализе воздействия пробиотиков и пребиотиков в контексте клинических испытаний на людях. Эти исследования будут оценены, чтобы понять проблемы в дизайне исследования, аналитических подходах и интерпретации. Кроме того, в центре внимания будут только те исследования, в которых использовался метаболомический подход, основанный на открытиях, для более полного изучения воздействия пребиотиков и пробиотиков на здоровье человека.

Исследования, которые соответствовали целевым критериям, были найдены в PubMed с использованием строки поиска (микробиом ИЛИ микробиота) И (метаболомика или «профилирование метаболита» или «метаболическое профилирование») или (пробиотики или пребиотики). Тщательный обзор позволил получить 15 исследований, в которых сообщалось о результатах какой-либо формы клинических испытаний на людях и которые включали метаболомический подход, основанный на открытиях. Было обнаружено, что эти исследования сосредоточены на пяти основных областях здоровья, и результаты этих исследований будут описаны ниже. Детали каждого из этих исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1. Описание клинических исследований пробиотических и пребиотических вмешательств на людях, которые включали использование основанного на открытиях метаболомического анализа.

2. Воздействие на здоровых людей

Один из основных вопросов, касающихся пребиотических и пробиотических вмешательств, заключается в том, насколько они могут влиять на сообщество и функцию здоровой кишки. Исследование Vandeputte et al. изучали эффекты фруктанов инулинового типа в рандомизированном двойном слепом плацебо-контролируемом перекрестном исследовании [14]. В этом исследовании 44 здоровых добровольца прошли двухнедельную фазу запуска, после чего последовало четырехнедельное вмешательство, двухнедельное вымывание и затем кроссовер.

Пребиотическое вмешательство состояло из ежедневного потребления инулина, полученного из цикория. Анализ микробного сообщества проводили с использованием секвенирования гена 16S рДНК. Результаты показали, что были значительные изменения в микробиоте с потреблением инулина. В частности, наблюдалось увеличение числа бифидобактерий (Bifidobacteria) и анаэростипов (Anaerostipes), а также уменьшение билофилии (Bilophilia). Увеличение количества бифидобактерий было ожидаемо, поскольку пребиотическая концепция фактически возникла из наблюдения селективной стимуляции бифидобактерий инулиновой ферментацией [1]. Метаболомический анализ использовал платформу ГХ-МС (газовая хроматография масс-спктрометрия) и был разработан, чтобы сосредоточиться только на летучих органических соединениях в соответствии с методом De Preter et al. [15]. Это давало значительно ограниченную картину фекального метаболома, оставляя практически без внимания все полярные соединения, включая важные органические кислоты, такие как лактат, сукцинат и формиат. Перекрестный анализ выявил один метаболит, додеканол, который увеличивался с потреблением инулина. Додеканол может иметь диетическое происхождение [16], но он также может быть результатом измененного пищеварения липидов в кишечнике [17].

Хотя анализы цитотоксичности и генотоксичности фекальной воды не выявили статистически значимой разницы между пребиотическим вмешательством и плацебо, PLS-DA показал, что профили метаболитов были сгруппированы в зависимости от степени цитотоксичности или генотоксичности образцов. Анализ показал, что кислоты, спирты и сложные эфиры ассоциированы с большей цитотоксичностью, в то время как циклоалканы и набор терпенов, включая α-пинен, α- и β-фелландрен, лимонен, 3-карен и камфен, ассоциированы с низкой токсичностью. Терпены являются вторичными метаболитами, продуцируемыми растениями, и, как было показано, обладают антиоксидантным и антимикробным действием [20]. Другим интересным метаболическим открытием было снижение изовалериановой кислоты с помощью WBEs. Эта жирная кислота с разветвленной цепью является маркером ферментации белка, который предполагает, что WBEs может изменить структуру ферментации толстой кишки, чтобы быть более сахаролитической, а не протеолитической.

В процессе старения наблюдались изменения в иммунной системе, и недавние исследования показали, что микробиота и микробный метаболом могут влиять на определенные иммунологические функции [21]. В исследовании Vulevic et al., Пребиотическое вмешательство с использованием смеси галактоолигосахаридов (GOS) было дано когорте пожилых пациентов для наблюдения за влиянием на кишечную микробиоту, фекальный метаболизм и иммунологические функции [22]. В исследовании приняли участие сорок здоровых пациентов в возрасте от 65 до 80 лет в рандомизированном двойном слепом плацебо-контролируемом перекрестном исследовании. Дизайн исследования включал десятинедельные вмешательства, разделенные четырехнедельным вымыванием. Было обнаружено, что вмешательство GOS оказывает иммуномодулирующее действие, включая изменения в NK-клетках и некоторых цитокинах, включая увеличение IL-10 и снижение IL-1β. Основные изменения в микробиоте оценивались с помощью флуоресцентной гибридизации in situ. Основное изменение включало увеличение количества бифидобактерий и бактероидов. Метаболомический анализ был проведен с использованием 1 Н ЯМР и показал, что повышенные уровни бифидобактерий коррелируют с повышением фекальных концентраций лактата, глутамата, орнитина и капроновой кислоты. Поскольку лактат является продуктом метаболизма бифидобактерий, этот результат поддерживает пребиотическое моделирование этой бактерии. Изменения в глутамате и орнитине, вероятно, связаны с изменениями в диете. Диетические записи не указывали на какие-либо различия в потреблении белка между группами лечения, но при корреляции уровней бифидобактерий с потреблением белка у всех испытуемых уровни потребления белка были выше у тех, у кого уровень бифидобактерий был выше. Данные метаболомики в этом исследовании подтвердили использование пребиотиков для изменения как уровня, так и функции бифидобактерий, а также продемонстрировали, как метаболомический анализ может дать дополнительную информацию о влиянии диетических моделей в исследовании.

3. Избыточный Вес / Ожирение

Первые ассоциации между микробиотой кишечника и ожирением были зарегистрированы Turnbaugh et al. в исследованиях с использованием фекальных трансплантатов от тучных людей к мышам без микробов [12]. При имплантации «тучной микробиоты» у мышей наблюдалось значительно большее увеличение жировых отложений, чем при имплантации «худой микробиоты». Учитывая Глобальное бремя ожирения для здоровья, существует большой интерес к поиску способов манипулирования микробиотой кишечника в качестве лечения ожирения. Поисковые параметры обнаружили два исследования, в которых пребиотики или пробиотики оценивались в исследованиях ожирения у человека с использованием метаболомики.

В исследовании женщин, страдающих ожирением, влияние фруктанов типа инулина (ITFs) было изучено для оценки влияния на микробный состав кишечника и системный метаболизм [23]. В этом двойном слепом плацебо-контролируемом вмешательстве участвовали 30 женщин с ожирением, ежедневно получавших добавки ITF в течение трех месяцев. 1 Н ЯМР анализ мочи и сыворотки выявил несколько интересных корреляций между изменениями метаболитов и кишечных бактерий. Уровни Propionibacterium и Bacteroides vulgatus были снижены при лечении пребиотиками и коррелировали с пониженными уровнями фосфатидилхолина и лактата в плазме. Уровни этих бактерий и метаболитов также, по-видимому, связаны с пониженным ожирением. Повышение уровня Collinsella, рода Actinobacteria, наблюдалось в группе пребиотиков и коррелировало с уровнями мочевого гиппурата. В отличие от большинства исследований, в которых основное внимание уделялось фекальным метаболомам, в этом исследовании были изучены моча и сыворотка, и было обнаружено несколько новых корреляций между кишечной микробиотой и уровнями системного метаболита.

Hibbert et al. сообщили об исследовании, включающем как пробиотические, так и пребиотические вмешательства в рандомизированном двойном слепом плацебо-контролируемом исследовании 134 взрослых с избыточной массой тела [24]. Это исследование включало четыре группы лечения (1) плацебо (микрокристаллическая целлюлоза) (2) лечение пребиотиком Litesse Ultra® полидекстроза (LU), (3) Bifidobacterium animalis subsp. Lactis 420® (B420) и (4) LU + B420 с продолжительностью вмешательства 6 месяцев. Фекальный метаболом анализировали с помощью 1 Н ЯМР, а сывороточные желчные кислоты измеряли с использованием UPLC/MS/MS, как описано Han et al. [25]. Результаты показали, что кишечная микробиота была модифицирована для всех групп, при этом вмешательство LU показало более сильный эффект, чем один B420. Численность семейства Christensenellaceae была значительно повышена в группах, получавших только LU и в комбинации с B420. Эти уровни также были положительно коррелированы с фекальными жирными кислотами с разветвленной цепью (BCFAs), изомасляной кислотой, изовалериановой кислотой, 2-метилмасляной кислотой и 3-метил-2-оксовалератом и желчными кислотами плазмы, литохолевой кислотой и гиодезоксихолевой кислотой. BCFAs обычно генерируются путем микробной ферментации непереваренных белков в толстой кишке, но было показано, что эти метаболиты могут быть получены в результате потребления полидекстрозы [26]. Недавнее исследование показало, что BCFAs влияют на метаболизм липидов и глюкозы в адипоцитах человека, ингибируя липогенез de novo [27]. В этом исследовании объединенные результаты анализа микробного сообщества и метаболомики дают новое понимание того, как эти вмешательства могут влиять на энергетический обмен хозяина.

Дополнительно см.:

4. Здоровье младенцев и детей

Было показано, что на состав микробиоты кишечника младенца существенное влияние оказывают диетические факторы [28,29]. Были показаны четкие различия в траектории развития микробного сообщества между грудными и искусственно вскармливаемыми младенцами [30,31]. Исследование, проведенное Bazanella et al. было разработано для оценки влияния вмешательства с добавлением пробиотической формулы на состав и функцию кишечника младенца в течение первого года жизни [32]. В этом рандомизированном двойном слепом плацебо-контролируемом клиническом исследовании новорожденным давали стандартную сывороточную смесь с добавлением Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium longum subspeces infantus или контрольную смесь без добавок. Контрольные группы, находившиеся на грудном вскармливании, также были включены в анализ. Когорта состояла из 49 младенцев в контрольной группе и 48 младенцев в интервенции. Разнообразие и состав фекальной микробиоты определяли с помощью секвенирования 16S рРНК, а фекальный метаболом был проанализирован методом UPLC/MS (ультраэффективной жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии). Младенцы в группе вмешательства показали снижение количества бактероидов (Bacteroides) и блаутии (Blautia), а также изменения в липидах и неизвестных метаболитах в течение одного месяца. В течение оставшегося периода исследования состав микробиоты и метаболома сходились. Достоверные различия наблюдались между детьми на грудном вскармливании и детьми, получавшими искусственное вскармливание, причем основные различающиеся метаболиты относились к стероидным липидам, глицерофосфолипидам и жирным кислотам. Целенаправленный анализ короткоцепочечных жирных кислот также может отличить грудных детей от детей, получающих искусственное вскармливание, при этом грудные дети имеют более низкие пропорции пропионата, бутирата, валерата и изовалерата (соли или эфиры изовалериановой кислоты), в то время как дети, получающие искусственное вскармливание, имеют более высокие количества пировиноградной кислоты и молочной кислоты.

Рецидивирующие инфекции дыхательных путей (RRIs) являются частым явлением у детей дошкольного возраста. Пидотимод (Pidotimod) является иммуностимулятором, который используется для лечения RRI у детей. Недавнее исследование метаболомики детей с RRI, принимающих Pidotimod, показало, что препарат может частично восстанавливать метаболические изменения, вызванные RRI, но некоторые метаболиты, полученные из микробиоты, оставались измененными [36]. В последующем исследовании, проведенном Santamaria et al., было проведено рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование, чтобы определить, могут ли пидотимод и / или пробиотик с бифидобактериями снижать заболеваемость RRIs и изменять профиль метаболизма мочи у детей дошкольного возраста. [37]. Когорта детей в возрасте 3–6 лет была случайным образом распределена по четырем группам, где субъекты получали лечение в течение первых 10 дней каждого месяца в течение четырех месяцев. Первичной клинической конечной точкой было количество дней без симптомов. У детей, получавших пидотимод с пробиотиком или без него, было значительно больше дней без симптомов. Метаболические профили были измерены у 25 пациентов с использованием UPLC / MS. Никаких существенных различий в метаболических профилях не наблюдалось между группой, принимавшей плацебо и пробиотики, но было обнаружено большое отличие между плацебо и пидотимодом, как с пробиотиком, так и без него. Используя общий и уникальный участок структуры, они обнаружили, что стероидные гормоны, метаболиты, полученные из пути витамина B, и некоторые аминокислоты были связаны с использованием Pidotimod. В крайних точках этого типа сюжета находятся метаболиты, которые могут быть связаны с интерактивным эффектом пидотимода и пробиотика. К ним относятся метилгиппуровая кислота, кинуренин, 3-глюкуронид дезоксихолевой кислоты и оксоглутаровая кислота. Этот набор метаболитов связан с рядом различных аспектов кишечного микробного метаболизма, включая метаболизм триптофана и желчных кислот. Однако этот паттерн не может быть обусловлен конкретно эффектами пробиотика, поскольку эти изменения наблюдались только при введении Пидотимода с пробиотиком или без него. Учитывая клинический исход, есть подозрение, что эти метаболиты каким-то образом связаны с усилением иммунной функции, но для уточненния требуется дальнейшая работа.

Пробиотики были использованы в ряде исследований у недоношенных детей, при этом большое внимание уделялось лечению некротического энтероколита и позднего сепсиса [38]. Что касается первых, то данные более чем 20 РКИ свидетельствуют о положительном влиянии пробиотиков [39]. В исследовании недоношенных детей, проведенном Abdulkadir et al., секвенирование 16S рРНК и метаболомика на основе LC/MS (жидкостной хроматографии масс-спектрометрии) были использованы для определения влияния пробиотиков на недоношенных детей в отделении интенсивной терапии новорожденных (ОРИТ) [40]. Пробиотик состоял из Lactobacillus acidophilus-NCIMB701748 и Bifidobacterium bifidum-ATCC15696 (продается как Infloran®). Образцы фекалий отбирали до, во время и после приема пробиотика у 7 пациентов и 3 контрольных пациентов с согласованным временем. Образцы также собирали после выписки из отделения интенсивной терапии. Профилирование бактериального сообщества показало большее количество Bifidobacterium и Lactobacillus во время пробиотической обработки по сравнению с контролем. После прекращения приема добавок уровни Lactobacillus снизились, но концентрации Bifidobacterium оставались высокими, что указывало на успешную колонизацию. Самое большое различие в профилях метаболизма было между субъектом после выписки по сравнению с таковыми в отделении интенсивной терапии. Это предполагает, что воздействие новой среды оказывает большее влияние на этих детей, чем пробиотик. К сожалению, конкретные назначения метаболитов в этом исследовании не проводились.

См. дополнительно:

5. Синдром раздраженного кишечника

Синдром раздраженного кишечника является наиболее распространенным функциональным расстройством кишечника и характеризуется ассоциацией боли в животе или дискомфорта с изменениями частоты или консистенции стула без четкой этиологии заболевания [41]. В исследовании Hong et al. целевые методы культивирования были объединены с метаболомикой для оценки влияния пробиотического йогуртового напитка на 74 пациента с СРК [42]. В этом рандомизированном двойном слепом плацебо-контролируемом клиническом исследовании субъекты употребляли пробиотический йогуртовый напиток три раза в день во время еды в течение восьминедельного периода. Пробиотическая терапия оказала положительное влияние на симптомы пациентов, включая боль, метеоризм и показатели дефекации. Количественные методы культивирования клеток показали, что уровни Lactobacillus spp. были значительно увеличены после восьминедельного исследования, в то время как уровни бифидобактерий не изменились.

Это наблюдение за липопротеинами позволило выявить некоторые потенциальные половые эффекты пробиотиков, но, к сожалению, широкие исходные характеристики этих макромолекул мешают количественно соответствовать пикам ЯМР. Спектральные профили сравнивались с использованием интегрального биннинга, которое является менее количественным из-за эффектов спектрального перекрытия и мешающих базовых компонентов. Этот подход анализа также использовался для фекальных образцов. Эти дополнительные источники изменчивости могут иметь ограниченную способность обнаруживать значительные различия метаболитов.

Некоторые из метаболитов, которые различают здоровых и больных СРК-D, указывают на изменения в метаболизме одного углерода, включая сывороточный метионин и саркозин, а также таурин в моче. Это побудило авторов использовать анализ на основе ИФА (иммуноферментного анализа) для измерения другого ключевого промежуточного соединения в одноуглеродном пути, гомоцистеина. Установлено, что уровни гомоцистеина в сыворотке крови повышены в группе СРК-D. После вмешательства уровни были еще более снижены, что позволяет предположить, что одним из механизмов, с помощью которого лечение с помощью синбиотика улучшает симптомы СРК-D, может быть модуляция одноуглеродного метаболизма.

6. Здоровье женщин / беременность

Вагинальная микробиота является частью сложной системы противомикробной защиты, которая защищает женщин от болезней [47]. В здоровом состоянии в микробиоте влагалища доминирует род Lactobacillus [48]. Считается, что лактат, вырабатываемый этими бактериями, создает кислую среду, которая ограничивает рост многих патогенных бактерий. Было показано, что предменопаузальная вагинальная микробиота обладает высокой динамикой по сравнению с постменопаузальным состоянием, вероятно, из-за эффектов гормонального цикла. В исследовании Bisanz et al., было проведено детальное изучение влияния пробиотического лечения на постменопаузальный микробиом влагалища [49]. В этом исследовании семеро испытуемых получали вагинальное введение пробиотика, состоящего из L. rhamnosis GR-1 и L. reuteri RC-14, а семеро получали лечение плацебо. Женщины были оценены с помощью балльной системы Ньюджента, которая используется для оценки бактериального вагиноза (БВ). Все женщины, участвовавшие в исследовании, имели промежуточные баллы, свидетельствующие о потенциальном риске перехода к БВ. Трехдневное лечение не повлияло на оценку Ньюджента, но наблюдались некоторые изменения в микробном сообществе. Анализ с секвенированием 16S рРНК выявил увеличение относительного обилия лактобацилл. Был проведен нецелевой анализ ГХ-МС, но не было обнаружено никаких различий между испытуемыми на пробиотике и плацебо. Получение достаточного количества образцов для метаболомики было отмечено как сложная задача с использованием вагинальных мазков, и были проанализированы образцы только от четырех женщин, которые продемонстрировали увеличение количества лактобацилл. Была обнаружена значительная положительная корреляция между уровнями лактата и количеством бактерий, продуцирующих лактат. Авторы признали, что это может показаться интуитивным открытием, но, насколько им известно, об этой взаимосвязи еще не сообщалось.

Следующее исследование использования пробиотиков для микробиоты влагалища, также проведенное лабораторией Reid, оценило использование оральных пробиотиков у беременных женщин в Руанде [50]. Использование пробиотиков не очень хорошо известно в развивающихся странах, таких как Руанда, но потенциал для лечения и профилактики заболеваний, которые поражают эти страны, таких как урогенитальные, диарейные и респираторные заболевания, очень высок [51,52,53]. В этом рандомизированном слепом плацебо-контролируемом клиническом исследовании в общей сложности 31 женщина завершила исследование (13 плацебо, 18 пробиотиков), получая ежедневные пероральные добавки в течение одного месяца. Влагалищные мазки использовали для сбора образцов для секвенирования 16S рРНК и метаболомики на основе ГХ-МС.

Полученные результаты показали ожидаемое низкое бактериальное разнообразие, связанное со здоровым влагалищем. Между плацебо- и пробиотическим лечением не наблюдалось существенных изменений в составе микробиоты влагалища. Точно так же никаких существенных изменений не наблюдалось и в вагинальном метаболоме. Интересно, что женщины в группе плацебо были значительно более склонны к преждевременным родам с тремя женщинами в группе плацебо по сравнению ни с одной в группе пробиотиков. Учитывая небольшой размер этого исследования, это интригующее открытие должно быть подтверждено в более крупной когорте. Дальнейший анализ данных метаболомики подтвердил ранее наблюдавшийся набор биомаркеров, ассоциированных с бактериальным разнообразием и бактериальным вагинозом [54]. Высокие уровни 2-гидроксиизовалерата и γ-гидроксибутирата, продуцируемых Lactobacillus crispatis и БВ-ассоциированными анаэробами, были значительно выше у испытуемых с высоким баллом Ньюджента.

7. Другие исследования

8. Обсуждение и выводы

С ростом интереса к использованию пребиотических и пробиотических вмешательств для широкого спектра заболеваний становится все более важным понимание подробных биохимических механизмов, посредством которых они функционируют. Как обсуждалось ранее, анализ структуры микробного сообщества с использованием методов секвенирования генов может не дать информацию о реальном функционировании бактерий. Несмотря на множество доклинических исследований, было проведено относительно мало исследований использования пробиотиков и пребиотиков в контексте клинических испытаний на людях, в которых использовались передовые методы метаболомики. Представленные здесь примеры охватывают ряд особенностей, включая патологическое состояние, размер когорты, частоту дозирования и продолжительность. Цель этого обзора состояла в том, чтобы оценить, как эти исследования были разработаны и проанализированы, и рассмотреть пути оптимизации будущих исследований.

Обзор схем исследования клинических испытаний, описанных здесь, показывает одну важную переменную, которая обычно не опрашивалась. Как указано в определении пробиотиков и пребиотиков, эти методы лечения необходимо «вводить в адекватных количествах», чтобы обеспечить благоприятные эффекты для хозяина. В описанных исследованиях доза, частота и продолжительность вмешательств были установлены в начале исследования, и не было дано четких указаний на то, как были получены эти параметры. Определение дозировки для фармацевтического препарата включает исследование доза-ответ с руководящим принципом «начинай с низкого, иди медленно». Поскольку пробиотики и пребиотики, как правило, считаются безопасными, такие исследования доза-ответ будут иметь гораздо меньший риск, чем с фармацевтическими препаратами. Очевидная проблема, связанная с исследованиями в диапазоне доз, заключается в том, что им потребуется большее количество пациентов для оценки эффектов дозирования, частоты и продолжительности, но в какой-то момент эти типы исследований должны быть выполнены. Наиболее практичные применения могут быть в четко определенных когортах, например, у пациентов с указанной патологией. Таким образом, итоговый фенотип должен быть достаточно сильным, чтобы меньшие когорты могли иметь статистическую силу для определения эффективной стратегии дозирования.

Как и в любом метаболомическом анализе, существует ряд аналитических источников вариации, которые необходимо учитывать. Спектр аналитических платформ, используемых в обсуждаемых здесь исследованиях, является репрезентативным для остальной части области метаболомики. Преимущества и недостатки этих платформ были подробно рассмотрены, и резюме различных платформ, используемых в анализе фекальных метаболитов, представлено в обзоре Karu et al. [73,74]. Учитывая сильные и слабые стороны каждой платформы, особенно с точки зрения чувствительности, количественной оценки и воспроизводимости, использование нескольких платформ было бы весьма выгодно. Примеры этого были приведены в нескольких представленных исследованиях, где глобальный нецелевой анализ сочетался с целенаправленной метаболомикой, чтобы обеспечить более количественные измерения важных метаболитов, таких как короткоцепочечные жирные кислоты, которые могут быть пропущены первичным нецелевым подходом.

Еще одним источником изменений в пробах фекалий является содержание воды. Фекальные образцы обычно содержат 60-85% воды, в зависимости от потребления клетчатки [76]. Эта вариабельность меньше, чем обычно обнаруживается в образцах мочи, но все же является значительной при поиске потенциально небольших изменений метаболитов. Как и в случае с образцами мочи, существуют методы обработки данных, которые помогут свести к минимуму эти эффекты. Часто используется «нормализация постоянной суммы», когда общая спектральная область для ЯМР и общее количество ионов для МС устанавливается на выбранное значение. Вероятностная нормализация частных показателей-это еще один метод постобработки нормализации, который был использован для учета изменчивости состава фекалий [77]. Альтернативно, данные могут быть собраны на лиофилизированных образцах, но это может повлиять на состав метаболитов. Интересно, что в большинстве рассмотренных исследований было включено мало подробностей о применении методов нормализации, что, возможно, снизило информативность исследований.

Исследования, рассмотренные здесь, демонстрируют потенциал метаболомики, способствующей пониманию того, как пребиотики и пробиотики функционируют у людей. Продолжение работы по разработке стандартизированных протоколов для фекальной метаболомики поможет минимизировать как биологические, так и аналитические источники вариаций. Эти разработки, наряду с использованием многоплатформенных подходов, обеспечат более подробные и всесторонние данные метаболомики. Объединение этих данных с продвинутым анализом микробного секвенирования поможет выяснить подробные биохимические механизмы, с помощью которых пробиотики и пребиотики могут оптимально применяться для улучшения здоровья человека.

Литература к подразделу III →

Дополнительная информация:

Будьте здоровы!

ССЫЛКИ К РАЗДЕЛУ О ПРЕПАРАТАХ ПРОБИОТИКАХ

Источник