Что такое световой микроскоп
Световые микроскопы и их виды
Световой микроскоп – это оптический прибор, позволяющий получить увеличенное изображение трудноразличимых невооруженным глазом или вообще невидимых объектов (либо деталей их структуры). В общем случае микроскоп состоит из штатива, предметного столика и подвижного тубуса с окуляром и объективом. Современные приборы оснащаются также специальной осветительной системой.
Микроскопы широко используются в самых разных отраслях промышленности, в области образования и науки, для проведения экспертиз. В зависимости от своего предназначения и конструктивных особенностей световые микроскопы подразделяются на металлографические, биологические, криминалистические, люминесцентные, поляризационные, инвертированные, стереомикроскопы и моновидеомикроскопы.
Биологические микроскопы
Наиболее знакомы обывателю биологические микроскопы. Их также называют лабораторными, медицинскими, микроскопами проходящего света и плоского поля. Их предназначение – изучение прозрачных и полупрозрачных объектов. Лабораторные микроскопы особенно широко применяются в различных областях биологии (ботанике, микробиологии, цитологии) и медицины, а также – в археологии, микроэлектронике, пищевой промышленности, геологии и т. д. Подобные устройства могут оснащаться или дополнительно комплектоваться специальными аксессуарами, насадками, светофильтрами, наборами объективов и окуляров, цифровыми фото- и видеокамерами.
Люминесцентные микроскопы
При работе люминесцентных микроскопов используются свойства флюоресцентного излучения, то есть способность некоторых объектов и красителей испускать свечение при облучении их ультрафиолетом или другими коротковолновыми лучами света.
Люминесцентный микроскоп снабжен мощным источником освещения с большой поверхностной яркостью, максимум излучения которого находится в коротковолновой области видимого спектра, системой светофильтров, а также интерференционной светоделительной пластинкой, применяемой при возбуждении люминесценции падающим светом. В современных люминесцентных микроскопах применяются специальные флюоресцирующие или ферментные метки, за счет чего удалось существенно уменьшить размеры оборудования. Подобные приборы особенно эффективны при исследованиях крови, клеток костного мозга, антигенных анализах.
Стереомикроскопы
Стереомикроскопы позволяют получать объемное изображение исследуемого объекта за счет наличия у него не одного, а сразу двух объективов, расположенных под углом. Стереомикроскопы обладают существенно большей глубиной резкости по сравнению с обычными микроскопами плоского поля. За счет наличия таких свойств подобные устройства могут эффективно использоваться в ряде областей промышленности, к примеру – в ювелирном деле. Помимо стандартных стереомикроскопов, получили распространение и цифровые модели.
Криминалистические микроскопы
Криминалистические микроскопы предназначены для одновременного сравнительного анализа двух объектов. Подобные экспертизы позволяют выявить идентичность таких предметов, как волосы, гильзы, пули, волокна, нитки, ткани и пр. Для исключения возможных ошибок сегодня широко применяется дополнительное цифровое оборудование и программное обеспечение. Криминалистические микроскопы могут использоваться в комплексе с фото- и видеокамерами и персональными компьютерами.
Металлографические микроскопы
Металлографические микроскопы предназначены для изучения структуры поверхности непрозрачных материалов, в первую очередь металлов и сплавов. Подобные исследования производятся в отраженном свете. Для получения желаемого эффекта используются специальные системы линз и зеркал. Металлографические микроскопы по своей конструкции могут быть прямыми или инвертированными, а также портативными. Наиболее эффективными являются современные цифровые модели, позволяющие производить максимально точные исследования поверхности изучаемых объектов. Подобные приборы применяются в металлургии, машиностроении, археологии, геологии и т.д.
Поляризационные микроскопы
Поляризационные микроскопы относятся к наиболее сложным в технологическом плане типам оптического оборудования. Они используются для исследования материалов, обладающих нестандартными (анизотропными) оптико-кристаллическими свойствами. В процессе работы формируется поляризованный световой поток, который облучает изучаемый образец. Поляризованные микроскопы наиболее широко применяются в минералогии, кристаллографии, петрографии, а также при проведении гематологических, гистологических и других медицинских и микробиологических исследований.
Инвертированные микроскопы
Инвертированные микроскопы отличаются тем, что их объективы находятся под исследуемым предметом. Это позволяет работать с достаточно большими по своему объему объектами, а также использовать специальную лабораторную посуду и инструменты. При этом инвертированные микроскопы могут быть биологическими, люминесцентными, металлографическими и пр. Подобные приборы широко используются при различных научных и лабораторных исследованиях в микробиологии, медицине, машиностроении, микроэлектронике и т.д.
Моновидеомикроскопы
Моновидеомикроскопы предназначены для получения видеоизображения наблюдаемых объектов с возможностью вывода на экран, записи и последующего анализа информации. При этом конструктивно устройство является объективом для камеры. Для эффективной работы моновидеомикроскопы можно дополнительно комплектовать необходимыми аксессуарами (предметными столами, линзами, фильтрами, осветителями, адаптерами).
Световой микроскоп
Микроско́п (от греч. μικρός — малый и σκοπεῖν — смотрю) — оптический прибор для получения увеличенных изображений объектов (или деталей их структуры), невидимых невооружённым глазом.
Содержание
История микроскопа
Невозможно точно определить, кто изобрёл микроскоп. Считается, что голландский мастер очков Ханс Янссен и его сын Захария Янссен изобрели первый микроскоп в 1590, но это было заявление самого Захария Янссена в середине XVII века. Дата, конечно, не точна, так как оказалось, что Захария родился около 1590 г. Другим претендентом на звание изобретателя микроскопа был Галилео Галилей. Он разработал «occhiolino» («оккиолино»), или составной микроскоп с выпуклой и вогнутой линзами в 1609 г. Галилей представил свой микроскоп публике в Академии деи Линчеи, основанной Федерико Чези в 1603 г. Изображение трёх пчел Франческо Стеллути было частью печати Папы Урбана VIII и считается первым опубликованным микроскопическим символом (см. «Stephen Jay Gould, The Lying stones of Marrakech, 2000»). Кристиан Гюйгенс, другой голландец, изобрел простую двулинзовую систему окуляров в конце 1600-х, которая ахроматически регулировалась и, следовательно, стала огромным шагом вперед в истории развития микроскопов. Окуляры Гюйгенса производятся и по сей день, но им не хватает широты поля обзора, а расположение окуляров неудобно для глаз по сравнению с современными широкообзорными окулярами. Антон Ван Левенгук (1632—1723) считается первым, кто сумел привлечь к микроскопу внимание биологов, несмотря на то, что простые увеличительные линзы уже производились с 1500-х годов, а увеличительные свойства наполненных водой стеклянных сосудов упоминались ещё древними римлянами (Сенека). Изготовленные вручную, микроскопы Ван Левенгука представляли собой очень небольшие изделия с одной очень сильной линзой. Они были неудобны в использовании, однако позволяли очень детально рассматривать изображения лишь из-за того, что не перенимали недостатков составного микроскопа (несколько линз такого микроскопа удваивали дефекты изображения). Понадобилось около 150 лет развития оптики, чтобы составной микроскоп смог давать такое же качество изображения, как простые микроскопы Левенгука. Так что, хотя Антон Ван Левенгук был великим мастером микроскопа, он не был его изобретателем вопреки широко распространённому мнению.
Недавние достижения
Немецкие ученые Штефан Хелль в 2006 году Stefan Hell и Мариано Босси Mariano Bossi из Института биофизической химии разработали оптический микроскоп под названием Наноскоп, позволяющий наблюдать объекты размером около 10 нм и получать высококачественные трёхмерные изображения. [1]
Применение
Человеческий глаз представляет собой биологическую оптическую систему, характеризующуюся определённым разрешением, т. е. наименьшим расстоянием между элементами наблюдаемого объекта (воспринимаемыми как точки или линии), при котором они ещё могут быть отличены один от другого. Для нормального глаза при удалении от объекта на т. н. расстояние наилучшего видения (D = 250 мм), среднестатистическое нормальное разрешение составляет 0,176 мм. Размеры микроорганизмов, большинства растительных и животных клеток, мелких кристаллов, деталей микроструктуры металлов и сплавов и т. п. значительно меньше этой величины. Для наблюдения и изучения подобных объектов и предназначены микроскопы различных типов. С помощью микроскопов определяли форму, размеры, строение и многие другие характеристики микрообъектов. Оптический микроскоп в видимом свете давал возможность различать структуры с расстоянием между элементами до 0,20 мкм. Так было до создания оптического микроскопа наноскопа. [2]
Устройство микроскопа
Оптическая система микроскопа состоит из основных элементов — объектива и окуляра. Они закреплены в подвижном тубусе, расположенном на металлическом основании, на котором имеется предметный столик.
В современном микроскопе практически всегда есть осветительная система (в частности, конденсор с ирисовой диафрагмой), макро- и микро- винты для настройки резкости, система управления положением конденсора.
В зависимости от назначения, в специализированных микроскопах могут быть использованы дополнительные устройства и системы.
Объективы
Иммерсия
Может быть сухой и масляной. а)сухая: показатель преломления равен 1; б)масляная: используется при работе с мелкими объектами, показатель преломления равен 1,33 Иммерсионное масло добывают из деревьев
Окуляры
Система освещения препарата
В первых микроскопах исследователи вынуждены были пользоваться естественными источниками света. Для улучшения освещённости стали использовать зеркало, а затем — и вогнутое зеркало, с помощью которого на препарат направляли лучи солнца или лампы. В современных микроскопах освещение регулируют с помощью конденсора.
Конденсор
Конденсор (от лат. condense — сгущаю, уплотняю), короткофокусная линза или система линз, используемая в оптическом приборе для освещения рассматриваемого или проецируемого предмета. Конденсор собирает и направляет на предмет лучи от источника света, в том числе и такие, которые в его отсутствие проходят мимо предмета; в результате такого «сгущения» светового потока резко возрастает освещённость предмета. Конденсоры применяются в микроскопах, в спектральных приборах, в проекционных аппаратах различных типов (например, диаскопах, эпидиаскопах, фотографических увеличителях и т. д.). Конструкция конденсора тем сложнее, чем больше его апертура. При числовых апертурах до 0,1 применяют простые линзы; при апертурах 0,2—0,3— двухлинзовые конденсоры, выше 0,3—трёхлинзовые. Наиболее распространён конденсор из двух одинаковых плосковыпуклых линз, которые обращены друг к другу сферическими поверхностями для уменьшения сферической аберрации. Иногда поверхности линз конденсора имеют более сложную форму — параболоидальную, эллипсоидальную и т. д. Разрешающая способность микроскопа повышается с увеличением апертуры его конденсора, поэтому конденсоры микроскопов — обычно сложные двух или трёхлинзовые системы. В микроскопах и кинопроекционных аппаратах широко применяют также зеркальные и зеркально-линзовые конденсоры, апертура которых может быть очень велика — угол 2u раствора собираемого пучка лучей достигает 240°. Часто наличие в конденсорах нескольких линз вызвано не только стремлением увеличить его апертуру, но и необходимостью однородного освещения предмета при неоднородной структуре источника света. [3]
Конденсор тёмного поля
Предметный столик
Предметный столик выполняет роль поверхности, на которой размещают микроскопический препарат. В разных конструкциях микроскопов столик может обеспечить координатное движение препарата в поле зрения объектива, по вертикали и горизонтали, или поворот препарата на заданный угол.
Вспомогательные приспособления
Предметные и покровные стёкла
Первые наблюдения в микроскоп производились непосредственно над каким-либо объектом (птичье перо, снежинки, кристаллы и т. п.). Для удобства наблюдения в проходящем свете, препарат стали размещать на стеклянной пластинке (предметное стекло). Иногда эту пластинку делали с лункой — для размещения объекта в капле воды. Позже препарат стали закреплять тонким покровным стеклом, что позволило создавать коллекции образцов, например, гистологические коллекции.
Классификация
Рабочие лабораторные микроскопы
Бинокулярные микроскопы
Бинокулярный микроскоп (иначе — стереомикроскоп) позволяет получать 2 изображения объекта, рассматриваемые под небольшим углом, что обеспечивает объёмное восприятие. В современных бинокулярных микроскопах одновременно используются два окуляра (по одному на каждый глаз) и обычно 1 объектив. Общее увеличение (объектив*оккуляр) бинокуляров обычно меньше, чем у монокулярных микроскопов. Бинокулярные микроскопы хорошо работают как в проходящем, так и в отражённом свете.. [4]
Наиболее широко бинокуляры используются для исследования неоднородностей поверхности твёрдых непрозрачных тел, таких как горные породы, металлы, ткани; в микрохирургии и пр.
Металлографические микроскопы
Специфика металлографического исследования заключается в необходимости наблюдать структуру поверхности непрозрачных тел. Поэтому микроскоп построен по схеме отраженного света, где имеется специальный осветитель установленный со стороны объектива. Система призм и зеркал направляет свет в объектив, далее свет отражается от не прозрачного объекта и направляется обратно в объектив. «.. [5]
Светлопольная (световая) микроскопия
Современная микроскопия имеет большое количество методов, на основании которых функционируют самые различные микроскопы, сферы применения которых весьма различны. И часто возникают споры и дилеммы о том, что же лучше: световой или, как его еще называют, оптический микроскоп, либо же электронный.
Стоит сразу отметить некоторый момент – это частая путаница в понятиях таких, как электронный микроскоп и микроскоп цифровой. Именно эти понятия так часто можно увидеть, когда их употребляют в неуместном варианте.
Строение светового микроскопа
В зависимости от комплектации световые микроскопы могут быть как самыми примитивными (например, которые используются в кабинетах физики в школе), так и состоять из сложных систем современного образца.
Из чего же состоит световой микроскоп? По структуре световой микроскоп имеет такие основные части:
Объект исследования получается увеличенным именно благодаря совместному воздействию таких структур микроскопа как: окуляр, объектив и зеркало. Технические аспекты обеспечивают все остальные составляющие микроскопа.
Благодаря окуляру, который находится в верхней части микроскопа, человеческий глаз наблюдает объект. В состав окуляра входят несколько увеличительных линз, заключенных в оправу. Нижняя линза окуляра отвечает за фокусировку объекта исследования, а верхняя линза обеспечивает процесс наблюдения. Окуляры обладают сравнительно малой степенью увеличения.
Важным параметром в выборе окуляра микроскопа является вынос зрачка, расстояние между глазом и отверстием окуляра. Если специалист будет работать с микроскопом в очках, то стоит выбирать микроскоп с большим выносом, равным 10-20 мм.
Трубка в форме цилиндра, к которой крепится окуляр, называют тубусом. В верхней части тубуса расположен окуляр, а в нижней части – устройство для крепления объективов. Движение тубуса обеспечивается винтами на штативе микроскопа. Такое движение тубуса определяет возможность контролировать расстояние до объекта исследования на предметном столике.
Сравнение электронного и светового микроскопа
Цифровые микроскопы – это лишь оборудование, которое выводит получаемое изображение из оптического микроскопа на экран монитора компьютера, при помощи чего исследователь может детально рассмотреть нюансы объекта. А электронный микроскоп имеет совершенно иной метод получения изображения: через объект проходят не световые лучи, а электроны, которые, ударяясь о поверхность объекта, формируют нюансы его поверхности и структурных особенностей. Они строят геометрический образ изучаемого объекта.
Конечно же, у оптического микроскопа есть свои преимущества, а также недостатки. Однако, каждый покупатель, выбирая такое оборудование, должен отталкиваться от его потребностей, а также сферы, в которой будет работать микроскоп, от направленности лаборатории.
Если речь идет о базовых задачах микроскопа, как, например, его использование в лаборатории школы института, которое обусловливает обучающие цели, тогда, конечно же, выбор падает на оптический (световой) микроскоп. В световой микроскоп можно увидеть все, чего требует базовая школьная программа по биологии.
Естественно, что покупка для таких целей какого-либо другого типа и класса оборудования просто необоснованно. Если же речь идет о какой-либо исследовательской лаборатории, где необходимы нюансы микроскопического строения объекта, как, например, в области вирусологии, криобиологии, томографии, либо нейрохирургии или же других узкоспециализированных областей, тогда, естественно, световой микроскоп будет неуместен для использования в таких направлениях деятельности.
Что это означает: преимущества светового микроскопа? Это означает лишь одно – о преимуществах либо недостатках конкретного вида микроскопа можно говорить только опираясь на сферу, в которой он будет использоваться. Так как. Например, в школьном кабинете биологии просто нецелесообразно использование дорогого, практически недоступного электронного микроскопа, когда можно использовать дешевый световой прибор, а в научно-исследовательском институте просто недопустимо и бесполезно будет использование оптического простого микроскопа, который попросту не даст никаких результатов в конкретной научной деятельности, так как его увеличения и разрешения просто не будет хватать для такой работы.
Преимущество светового микроскопа перед электронным
Если попросить работника лаборатории «определи преимущество использования световой микроскопии перед электронной», то даже начинающий исследователь сможет назвать основные плюсы работы с таким видом оборудования.
Поговорим о микроскопах
Помнится, в далеком детстве мне подарили микроскоп «Натуралист» – игрушечный, но таки дающий фиксированное увеличение аж в шестьдесят раз. Состоял он из одной трубки, закрепляемой на пластмассовом футляре, одновременно играющим роль основания. Сколько интересных вещей тогда было пересмотрено через окуляр, подсвеченный тусклым зеркальцем – от листьев водорослей до целого таракана…
Рис. 1. Детский микроскоп «Натуралист» (за неимением лучшего — фото с торговой площадки)
С тех пор прошло более тридцати лет, но о детском увлечении я не забыл. И вот однажды под влиянием приступа ностальгии я решил купить себе такую же игрушку, только чуть посовременнее. Но первый же взгляд на соответствующий раздел Интернет-площадки показал: чего-то я в этой жизни не понимаю. От обилия самый разных устройств, описываемых одним и тем же словом «микроскоп», просто рябило в глазах. И вот вместо пары быстрых щелчков мышкой пришлось плотно сесть и разобраться хотя бы в самых азах современной микроскопии. Результаты ниже.
Предупреждение: обзор не претендует на исчерпывающее описание и рассчитан на энтузиастов-любителей, интересующихся предметом для себя или для детей. Статья не содержит никакой теории, связанной с оптикой, ее в избытке хватает в других материалах.
Типы микроскопов
Существует довольно много самых разных задач, в которых необходимо детально рассмотреть мельчайшие детали объектов – от драгоценных камней и монет до внутренностей живой клетки. От того, что и как нам нужно увидеть, сильно зависят и применяемые методы. Оставим сейчас за кадром самые мелкие объекты типа вирусов или молекулярной структуры вещества и сосредоточимся на более крупных предметах размерами от бактерии и выше. Оптические устройства, применяемые для таких задач, делятся на два больших класса: биологические (компаундные) и стереомикроскопы.
Подробно останавливаться на стереомикроскопах не станем. Замечу только, что, вопреки подсознательным ожиданиям от названия, данный класс устройств предназначен не для создания стереокартинок. Стереомикроскопы используются для обследования сравнительно крупных непрозрачных предметов в отраженном свете: микросхем, камней, насекомых и т.п. Они отличаются сравнительно небольшим оптическим увеличением (40-60-80х, хотя наиболее продвинутые могут иметь даже 200х) и часто снабжены встроенными мониторами либо цифровыми интерфейсами. Источник света находится над образцом. Размеры – от карманных устройств до солидных стационарных установок.
Некоторые стереомикроскопы для промышленных целей даже лишены оптического окуляра и предназначены исключительно для подключения к компьютеру/смартфону через USB/WiFi («цифровые микроскопы»). Такие микроскопы сравнительно дешевы. Если надо как следует рассмотреть таракана, бриллиант или распайку элементов на плате, этот тип устройств для вас. Только помните, что супер-увеличения типа 1600х, которые часто можно встретить в описаниях даже самых дешевых устройств, относятся к цифровому увеличению и даже близко не отражают реальное оптическое. Каково оно? А кто его знает, производители до таких деталей не снисходят.
Рис. 2. Aomekie stereo microscope с увеличением 20х/40х (фото производителя)
Биологические микроскопы
Основной класс устройств, на котором мы сконцентрируемся – то, что называется биологическим микроскопом, в английской терминологии «компаундным» (составным, от compound). Он предназначен для рассматривания тонких прозрачных образцов (срезы тканей, бактерии, микроорганизмы и т.п.) в проходящем свете. Образец подготавливается на предметном стекле, умещаемом на рабочей платформе, источник света – внизу, под образцом.
Следует понимать, что под биологический микроскоп того же таракана засунуть сложно: для мощной оптики, где расстояние между линзой и препаратом составляет буквально десятую долю миллиметра, препарат должен быть очень тонким, плоским и прозрачным, специально подготовленным и, возможно, окрашенным. Обычно это капля или тонкая пленка, размещенная между предметным и покровным стеклом. Под маломощный объектив таракан влезет (фокусное расстояние у них от нескольких миллиметров до нескольких сантиметров). Однако следует озаботиться хорошим внешним источником света и не стоит рассчитывать на высокую глубину резкости: в каждый момент времени вы сможете отчетливо видеть только определенный слой изображения.
Типовой биологический микроскоп состоит из трех частей: механическая платформа (база, предметный столик, устройства наведения и фокусировки), подсветка и оптическая система.
Рис. 3. Микроскоп Celestron (фото производителя)
Механическая платформа
Механическая часть состоит из основания, на которой монтируются все прочие компоненты, и предметного столика, на котором умещается образец. Очень важной частью механики является система, отвечающая за перемещение предметного столика в трех измерениях – именно так образец подводится в точку фокуса неподвижного объектива. Существуют модели, в которых перемещается объектив, но это редкая экзотика. В устройствах начального уровня механика самая примитивная. Подстройка по высоте (фокусировка) есть только грубая (coarse), перемещение образца в плоскости – пальцами.
В более сложных моделях в дополнение к грубой фокусировке появляется тонкая (fine), а также зажим, перемещающий предметное стекло в горизонтальной плоскости (его подвижная сторона имеет характерный вид полумесяца, ее хорошо видно на изображениях устройств). В наиболее простых микроскопах вертикальное перемещение регулируется разными винтами/рукоятками, в более продвинутых они совмещены на одной оси. В микроскопах без тонкой фокусировки есть реальная опасность раздавить как предметное стекло, так и линзу объектива из-за неловкого движения руки.
Материал корпуса – пластик либо металл. Пластик легче, но и хрупче. Обычно он применяется в мобильных моделях, предназначенных для детей либо полевых лабораторий – там, где важно минимизировать вес. Для стационарных микроскопов используется металл: он не только прочнее, но и менее подвержен вибрациям, которые на высоких увеличениях становятся критичными. Вес металлического микроскопа – 3-4 килограмма.
Исторически база микроскопа состояла из неподвижного основания и подвижного кронштейна, позволяющего менять ориентацию микроскопа относительно вертикали. Это было необходимо не только для комфорта работы, но и для получения качественной подсветки. Однако современные микроскопы имеют монолитное основание с фиксированным углом наклона глазных тубусов, что не всегда удобно. Учтите, что от этого угла прямо зависит комфорт вашей шеи во время работы, так что подбирайте устройство с углом, подходящим именно вам.
Рис. 4. AmScope M500 с простейшим предметным столиком без перемещения в плоскости (фото производителя)
Электрические компоненты
Мало подвести образец в точку фокуса, его надо еще и правильно подсветить. Плохая подсветка приведет к слишком темному или, наоборот, пересвеченному неразборчивому изображению, а также к неоднородному освещению поля.
Исторически для подсветки использовалось вогнутое зеркало, расположенное под отверстием в столике. Однако с его помощью сложно добиться качественного равномерного освещения поля зрения, что критично на высоких увеличениях. Также оно накладывает очень серьезные ограничения по размещению микроскопа относительно источника света, а также на сам источник. Такое зеркало сегодня осталось только в самых примитивных устройствах, обычно в полевых либо детских микроскопах, как в показанном в начале статьи «Натуралисте». Иногда, впрочем, оно может поставляться как дополнительная опция, замещающая основной источник света.
Сегодня для подсветки используются разные виды встроенных в основание ламп. До относительно недавнего времени применялись лампы галогенные или накаливания, но они имели свои проблемы. В первую очередь – из-за того, что свет генерировался тонкой нитью, а проецировать его приходилось на круглое поле, что, опять же, создает проблемы с равномерностью. Однако в современных условиях индустрия широко использует LED-источники света, что проблему сняло.
Запитывается подсветка либо от батареек (такие микроскопы особенно хороши для детей, поскольку их можно повсюду таскать с собой), либо проводом от розетки. Если заказываете проводное устройство за рубежом, помните о переходниках для вилки.
Регулировка подсветки выполняется как интенсивностью лампы, так и световым конденсором под рабочим столиком, имеющим диафрагму и линзу для фокусировки света на образце. В недорогих моделях наиболее распространен конденсор Аббе (Abbe condenser) или его модификации, это название можно часто увидеть в описании микроскопа. Для любительских занятий обычно применяется подсветка вида «светлое поле» (в смысле, прозрачные объекты рассматриваются на ярком белом фоне), хотя есть и другие типы: «темное поле», дающее инвертированное изображение, флуоресцентная подсветка и т.п. Конденсор может быть сменным, позволяя получать в одном и том же микроскопе разные типы подсветки.
Попадаются также модели с дополнительной верхней подсветкой, как на картинке ниже (этакий гибрид биологического и стереомикроскопа), но обычно это удел любительских устройств и малых увеличений: мощные объективы, практически втыкающиеся в покровное стекло, попросту заслоняют верхний свет. На практике уже сорокакратный объектив даже при хорошей внешней подсветке почти ничего не видит, а стократный показывает полный мрак.
Обратите, кстати, внимание: микроскоп на картинке не обладает полноценным конденсором, вместо него – только источник света и диафрагма. На столике присутствуют только самые примитивные зажимы-клипсы для предметного стекла, перемещение препарата в плоскости – пальцами.
Рис. 5. Любительский микроскоп Swift SW150 входного уровня с дополнительной верхней подсветкой (фото производителя)
Оптическая система – объективы
Оптическая система состоит из объективов (смотрят непосредственно на образец) и окуляров (eyepiece, прилегают к глазу).
Объективы, непосредственно рассматривающие образец, монтируются на револьверном диске для быстрой их смены. По нынешним временам они имеют четыре типовых диапазона увеличения: 4-5х (сканирующий объектив, обычно служит для грубой наводки на цель), 10-15х (маломощные линзы), 40-60х (высокомощные) и 90-100х и выше (сверхмощные). Объективы с увеличением выше 100х встречается редко и уж точно не в любительских микроскопах.
Первые три типа («сухие») обычно стандартны для всех моделей, даже для детских. Последний тип объективов встречается в более продвинутых моделях и для получения качественного изображения требует специальной техники использования – иммерсионной. Суть в том, что коэффициенты преломления воздуха и стекла разные для разных длин волн (именно на этом основано разложение белого цвета в спектр). Если между образцом и объективом есть воздух, на стократном увеличении проявляется сильная хроматическая аберрация, снижающая резкость вплоть до полной неразборчивости.
Поэтому для сильных (девяностократных и выше) объективов обычно используется техника погружения (иммерсии) передней линзы объектива в специальное масло, имеющее тот же коэффициент преломления, что и стекло. На покровное стекло наносят каплю масла, в которое непосредственно опускается объектив. После исследования масло с линзы смывается. Такие объективы обычно помечаются словом oil. Могут они использоваться и насухо, но добиться высокой резкости в этом случае невозможно. Масло входит в начальный комплект микроскопа с такими объективами, а также может быть куплено отдельно (из натуральных масел идеально подходит кедровое). Масляную иммерсию нельзя использовать с менее мощными объективами, для которых она не упомянута явно.
Что интересно, еще в середине прошлого века иммерсионными были даже объективы 50х, но с тех пор техника заметно продвинулась вперед. Исторически первой иммерсионной жидкостью являлась обычная вода (техника изобретена еще в начале 19 в.), подходящее масло впервые подобрали ближе к концу того же столетия.
Также стократные объективы могут напрямую упираться в покровное стекло препарата. Защита фронтальной линзы обычно выполняется с помощью специальной пружинящей оправы (слово spring в описании объектива). Несколько раз в описаниях также попадалось слово feather вместо spring, хотя найти определение мне так и не удалось. Для любительских исследований такие объективы избыточны как с точки зрения дополнительной немалой цены, так и с точки зрения затрачиваемых усилий. Особой дополнительной ценности в домашних условиях они не представляют.
Рис. 6. Набор ахроматических объективов фирмы OMAX с типичными мощностями 4х, 10х, 40х и 100х (фото производителя). На стократном объективе хорошо видна пружинящая оправа
Оптическая система – окуляры
Сменные окуляры вставляются в тубусы в верхней части микроскопа и имеют свое собственное фиксированное увеличение, например 10х, 16х, 25х. Чем выше увеличение, тем короче окуляр. Очкарикам типа меня надо держать в уме, что, в отличие от фотоаппарата, работа с окуляром микроскопа в очках крайне затруднена: окуляр должен практически прижиматься к глазу. Вынос зрачка (eye relief) у обычных окуляров составляет 7-13 мм, с очками нужны специальные окуляры с высоким выносом (15-20 мм). Однако это особой проблемы не составляет. В любом случае резкость в микроскопе подстраивается под глаз индивидуально. Даже с самой высокой близорукостью в микроскопе можно видеть резкое изображение. Неудобство только в том, что очки все время приходится снимать и надевать.
Окуляры могут быть широкофокусными (помечаются буквами WF, wide focus). Такой окуляр имеет большую ширину поля зрения, что заметно облегчает работу с широкими препаратами.
Также следует упомянуть линзу Барлоу (Barlow lens). Это дополнительная трехслойная линза, помещаемая в тубус оптического прибора перед окуляром и дающая небольшое дополнительное увеличение. Как правило, в комплекте поставки микроскопа можно встретить линзы Барлоу 2х. Это банальный маркетинговый трюк. Дешевые ахроматические стеклянные (или даже, упаси боже, пластиковые) линзы заметно ухудшают качество изображения, а потому при мощном увеличении бессмысленны. При низких же и средних сочетания объектива и окуляра вполне достаточно.
По количеству окуляров микроскопы делятся на классические монокулярные (один окуляр), бинокулярные (два окуляра, чтобы смотреть обеими глазами) и тринокулярные (третий тубус/порт обычно монтируется вертикально и служит для подсоединения фото- или видеокамеры).
Наиболее прост в использовании монокуляр. К нему очень легко привыкнуть, а проблему он создает единственную – сильную нагрузку на один глаз при расслабленном другом. При долгом использовании это может кончиться неприятными последствиями для зрения.
Бинокулярные микроскопы используются для обоих глаз сразу и создают стереоизображение. Они позволяют регулировать расстояние между окулярами для подгонки под свои зрачки. Также один из тубусов бинокуляра содержит регулировку, позволяющую компенсировать разницу в диоптриях между глазами. Следует держать в уме, однако, что создание цельного изображения при использовании бинокуляра гораздо сложнее, чем с монокуляром, к нему следует привыкать. Кроме того, регулировка имеет свои ограничения по расстоянию между зрачками, так что подстройка под ребенка может оказаться невозможна. Детский микроскоп следует брать монокулярный, да и для эпизодических любительских упражнений бинокуляр особо не пригодится.
Тринокулярные устройства выглядят эффектно и удобно, если речь идет о трансляции изображения наружу одновременно с работой. Однако следует учитывать, что не всегда все три порта могут использоваться одновременно. Встречаются решения, в которых, например, приходится выбирать между одним из глазных тубусов и третьим портом.
Рис. 7. Тринокуляр Omax M837ZL с вертикальным портом для камеры (фото производителя)
Оптическая система – заключение
Суммарная мощность биологического микроскопа вычисляется как произведение увеличений окуляра и объектива. Например, с объективом 40х и окуляром 10х общее увеличение составит 400х. Однако следует учитывать, что для стандартных ахроматических линз добиться четкого изображения на сверхмощном увеличении из-за законов оптики практически невозможно. Начиная с определенного момента, линзы будут только увеличивать уже видимые детали, но не добавлять новые. Максимальное эффективное оптическое увеличение составляет примерно 1500х, а то и меньше, в домашних условиях 1000х – практический потолок. Для более высоких разрешений применяются дорогие апохроматические линзы либо электронные микроскопы, что уже совсем другая песня.
Вообще 1000х – много это или мало? Размер золотистого стафилококка – около 1 мкм (1/1000 мм), амебы – 200-600 мкм, одноклеточной водоросли – около 40 мкм. Тысячекратного увеличения вполне хватит, чтобы разглядеть все это с подробностями. Так что не обращайте особого внимания на маркетинговые цифры максимального увеличения 2500-3000х, получаемого тупым перемножением максимальных мощностей объективов и окуляров. Установить вы его установите, только в результате получится как в песне «Сиреневый туман под линзой проплывает…»
При работе с препаратами также важна правильная установка диафрагмы конденсора. Узкая диафрагма повышает контрастность и резкость, но затемняет изображение. Широкая диафрагма пропускает больше света, но может сделать изображение пересвеченным и малоконтрастным, скрывая детали и даже целые объекты. Подбор диафрагмы для каждого препарата выполняется индивидуально.
На картинке ниже обратите внимание на вращающуюся головку микроскопа, позволяющую ориентировать окуляры в нужном направлении. Такая конструкция удобна при работе нескольких человек. Однако подстраивать резкость под свои глаза каждому все равно придется индивидуально.
Рис 8. Бинокулярный микроскоп Motic BA80 (фото производителя). Под столиком в центре хорошо виден конденсор, на столике – месяцевидный зажим для предметного стекла
Оптическая система – сопряжение микроскопа с компьютером
Подключение микроскопа к внешним устройствам, таким как монитор или компьютер, выполняется за счет установки специальной видеокамеры *вместо* окуляра или в выделенный порт тринокуляра. Следует держать в уме, что в этом случае теряется увеличение, даваемое окуляром, остается только увеличение объектива и нерегулируемых линз камеры. В параметрах камер обычно указывается только емкость ее матрицы (3, 5, 10 и более мегапикселей), оптическое увеличение остается тайной за семью печатями. Кроме того, поле зрения камеры существенно уже, чем у человеческого глаза.
Сама по себе камера может не распознаваться стандартными средствами Windows и приложений (и не надо – без микроскопа она полностью слепа), так что производители прилагают к ней специализированный софт. Он позволяет как делать фотографии, так и записывать видео. На рынке есть разные виды камер – от стареньких с разрешением 640х480 до современных с разрешением аж до 20 мегапикселей. Отличаются они также интерфейсами, что влияет на возможности записи видео в первую очередь (получение видеопотока с высоким FPS и разрешением через USB 2.0 будет затруднительно). Также камеры могут подключаться напрямую к монитору или иному устройству через HDMI, иметь WiFi-интерфейс и т.п.
Многие производители предлагают для своих микроскопов также и камеры, но никто не мешает купить камеру от другого вендора. Следует только учитывать, что диаметр тубуса у разных микроскопов может отличаться, так что следует удостовериться, что данная камера подходит для данного тубуса. Ну, или использовать переходники, которые тоже продаются. Стандартный диаметр для окуляра биологического микроскопа – 23,2 мм, стереомикроскопа – 30 и 30,5 мм.
Существуют также относительно дешевые насадки, позволяющие перенаправлять оптический поток из окуляра в объектив камеры смартфона. Плюс такого устройства – сохранение оригинального увеличения, поскольку монтируются они поверх окуляра. Минус – возможности получения и сохранения изображения ограничиваются невеликими возможностями смартфона. Ну, и поле зрения у такой камеры все равно уже, чем у глаза.
Рис. 9. Цифровая камера для микроскопа Puls Life Science DCM-310 (фото производителя)
Цены и производители
Цены на биомикроскопы можно найти самые разные. Те, что позиционируются для детей, попадаются и за 30-40 евро, однако следует помнить о возможных ограничениях типа фиксированного окуляра 10х, не поддерживающего установку камеры, отсутствия конденсора, а то и вообще подсветки, примитивном предметном столике и т.п. В Европе можно купить монокулярные микроскопы с тремя объективами, рассчитанные на энтузиастов и студентов, их ценовая категория – от 100 евро. Камера для микроскопа – от 50 евро (и далее в космос: двадцатимегапиксельная может стоит и семь сотен). Более профессиональные микроскопы – би- и тринокуляры со стократными объективами – стоят от 250 евро. Наконец, многие вендоры предлагают комплекты, специально рассчитанные на детей, студентов и энтузиастов. В них могут входить монокуляр входного уровня, простенькая видеокамера, базовый набор инструментов и предметных стекол и т.п. Цены на такие комплекты начинаются от полутора сотен евро.
К покупке следует обязательно добавить минимум один набор из предметных и покровных стекол (от 8-10 евро – учтите, это расходный материал), а также, по желанию, набор заранее подготовленных препаратов (крылья, ноги, хвосты, листики и подобные нехитрые препараты для вхождения в тему). Ну, а дальше – скальпели, пинцеты, микротомы, чашки Петри, пробирки, препараторские иглы и так далее, и тому подобное в зависимости от ваших увлечений. Также обязательно купите изопропиловый спирт (чем выше концентрация, тем лучше), кисточки, продувки, салфетки из микрофибры и т.п. – оптика имеет свойство пачкаться и пылиться, а даже отдельные пылинки на линзах микроскопа отобьются пятнами на изображении.
Учитывайте также, что цены на одни и те же товары на американском, английском и немецком Амазонах, не говоря уже про eBay, могут очень существенно различаться, так что после выбора модели стоит порыться на разных площадках в поисках цены пониже. Также можно искать микроскопы на Алиэкспрессе. Однако хотя там цены заметно ниже, чем в Европе, цена на доставку оказывается сопоставима с ценой самого микроскопа, что полностью лишает затею смысла.
Какой бренд выбрать? Поскольку оптика для микроскопов критично важна, на этом рынке отметились крупные мировые производители, связанные с оптикой – Олимпус, Цейс, Лейка, Никон и так далее. Однако цены на их устройства даже входного уровня, мягко говоря, не радуют, да и в розницу они могут просто не работать. Так что любителю стоит приглядеться к более демократичным вендорам, таким как Swift, Bresser, Omax или AmScope. Также можно приобрести отдельные объективы и окуляры, в том числе китайского производства (есть неплохие, судя по отзывам), но в этом случае нужно удостовериться что они совместимы с микроскопом. Европейский стандарт, определяющий резьбу и прочие механические и оптические параметры, называется DIN.
Немного практики. Игрушка в реальности
После месяца мучительных раздумий, в которых детское «хочу!» отчаянно боролось с взрослой скупостью и рационализмом, я остановился на бинокуляре Swift 350B. Почему? Ничего особенного: микроскопы Swift при умеренных ценах имеют качество, подходящее даже для лабораторных условий. Плюс на осенней распродаже на английском Амазоне эта модель продавалась всего за 160 фунтов. Чтобы два раза не вставать, вторым компонентом покупки стала трехмегапиксельная камера Swift стоимостью 80 фунтов.
Выглядит комплект поставки микроскопа примерно так:
Четыре объектива (4х, 10х, 40х и 100х) уже установлены в револьверное кольцо, наборы окуляров (10х и 25х) вложены отдельно. Обратите внимание на пустую вертикальную выемку над головкой и два пустых гнезда – упаковка универсальна и рассчитана в том числе на тринокуляры. Шнур/гнездо питания – C13/C14, блок питания встроен в основание. В комплект входит простенький пластиковый чехол а-ля «мешок мусорный обыкновенный».
В сборе и с подключением к ПК выглядит так (на мониторе – транслируемое с микроскопа изображение пчелиной ноги):
Теперь посмотрим, как выглядят образцы с разным увеличением при трансляции с камеры. Начнем с препарата листа флокса (поперечный срез) из продаваемого набора образцов. Использованы объективы 4х, 10х, 40х и 100х (без масла).
(4х)
(10х)
(40х)
(100х)
Как видно, без иммерсии стократный объектив ничего внятного не показывает. Сорокакратный показывает, но из-за малой глубины резкости приходится выбирать, какой слой препарата рассматривать. Поскольку вместо окуляра использована оптика камеры, финальное оптическое увеличение я определить затрудняюсь. Для сравнения: на снимке ниже то, что видит камера сотового телефона через окуляр 25х и объектив 4х (итоговое увеличение 100х). Снималось с рук, поскольку держатель для телефона я не купил, отсюда обрезанность по бокам.
Можно предположить, что камера дает увеличение 20-25х, но какова его часть оптическая, а какова цифровая, определить сложно.
Второй препарат – сделанный самостоятельно. Просто капля воды из кухонной раковины под покровным стеклом без какой-либо подготовки. Объективы те же: 4х, 10х, 40х.
(4х)
(10х)
(40х)
Обратите внимание на радужную кайму по границе капли (дугообразная черная линия на втором и третьем снимках). Если на 4х аберраций не видно никаких, то на 10х уже появляется слабое искажение цветов на границах объектов. На 40х радуга становится настолько заметной, что отчетливо видна даже на снимке камеры и заметно ухудшает резкость. Именно для ликвидации такого эффекта стократные объективы погружают в масло.
Для сравнения: что видит камера смартфона через окуляр при с комбинацией 4х * 25х:
Напоследок пара слов о стеклах. Препарат, помимо наблюдаемого объекта, состоит из толстого предметного стекла и тонкого покровного. Предметное стекло кладется на столик, покровное обращено к окуляру. Следует быть чрезвычайно осторожным при работе с покровными стеклами: при толщине 0,13-0,17 мм они имеют весьма острые грани, несмотря даже на специальную их обработку. При неаккуратном обращении они могут запросто распластать вам палец, а то и сломаться в ране. Ни в коем случае не позволяйте работать с ними малым детям, да и подростков тоже следует проконтролировать на начальном этапе.
По окончании работы с препаратом следует либо как следует очистить и обезжирить стекла. Остатки жира и масла приведут к тому, что капля будет не растекаться по стеклу, а разбиваться на еще более мелкие капли, затрудняя рассмотрение. В лабораториях применяются разные методы обезжиривания, но они небезопасны и требуют специальных химикатов, зачастую ядовитых, и оборудования типа вытяжек. В домашних условиях наиболее простой способ – изопропиловый спирт либо получасовое кипячение на медленном огне в растворе 2-5% растворе пищевой соды (примерно чайная ложна на 100 мл). Грязное покровное стекло, скорее, проще выбросить – оно слишком хрупкое и легко ломается. Да и за предметные стекла тоже особо держаться не стоит – это дешевый расходный материал. Иммерсионные объективы от масла чистятся так же, как и любая другая оптика: изопропиловым спиртом на микрофибре.
На этом введение в основы оптической микроскопии закончены. Успехов в самостоятельном плавании.