Что такое биологический иммерсионный микроскоп

Иммерсионная микроскопия

Иммерсионная микроскопия – это методика микроскопического исследования различных объектов, основанная на введении между объективом и предметным стеклом иммерсионных жидкостей.

Данный иммерсионный метод микроскопии применяется для того, чтобы свет проходил через рассматриваемый предмет, иммерсионную жидкость, при этом луч не преломлялся. Благодаря этому происходит получение изображения более высокого качества и разрешения.

У «сухих» объективов по сравнению с иммерсионными значительно больше «паразитных» отражений, чего нельзя сказать о последних. За счет этого специалист, работающий на иммерсионном микроскопе, получает значительно увеличенное качество изображения, к тому же с повышенной контрастностью.

Немаловажным моментом в иммерсионном микроскопе является та самая жидкость, благодаря которой и получается изображение такого качества. При прохождении светового луча через предметное стекло с препаратом, он сталкивается в последующим с иммерсионной средой, которой является иммерсионная жидкость. Именно за счет нее происходит уменьшение преломления данного светового луча, и именно поэтому в объектив попадает гораздо больше света, что дает такую яркую, четкую картинку у исследователя.

На иммерсионном объективе всегда есть соответствующая маркировка, которая говорит о том, какой тип иммерсии имеется в нем:

Начало применения иммерсионных микроскопов ознаменовалось такими масляными иммерсионными средами, как кедровое масло, глицерин, масло вазелиновое. Однако, с течением времени ученые выяснили тот факт, что их свойство значительно меняется, масло начинает менять консистенцию, загустевания, вплоть до того, что становиться твердой массой, меняется его цвет, а, следовательно, и коэффициент преломления при микроскопировании. Что уже дает негативный эффект при проведении микроскопического исследования объекта. Именно поэтому было принято решение использовать только лишь синтетические масла в качестве иммерсионных сред, которые не обладают такими негативными моментами как натуральные продукты.

К тому же в современных вариантах иммерсионных микроскопов используются объективы, на которые нанесено специальное покрытие, которое улучшает цветопередачу при иммерсионной микроскопии, а также имеет защитные свойства, которые защищают объектив от мелких царапин в процессе эксплуатации соответствующего оборудования.

Источник

Иммерсионная система микроскопа

Многие начинающие любители микробиологии при упоминании иммерсионной системы представляют себе нечто сложное, дорогостоящее и совершенно им не нужное. Мол, это какая-то узкоспециализированная вещь, которая пригодится лишь профессионалам, а в домашнем хобби она совсем не нужна. Это не совсем верно. Возможно, она не всегда и всем пригодится, но точно проста в использовании и доступна многим. Иммерсионная система микроскопа – это всего лишь иммерсионный объектив. Как только вы установите его на свой микроскоп, он тут же превратится в иммерсионную систему. Иммерсионный объектив подойдет практически к любому световому микроскопу, а купить его можно в большинстве специализированных магазинов. Однако зачем он все-таки нужен?

Микроскоп с иммерсионным объективом используется для наблюдений иммерсионным методом. Согласно ему между объективом и образцом вводится жидкость, благодаря которой увеличивается разрешение и яркость изображения, уменьшается хроматизм картинки, а паразитные отражения практически исчезают. Иммерсионная жидкость также позволяет превысить высший предел увеличения микроскопа. Иммерсионное увеличение микроскопа может в 1,5–2 раза превышать максимальное полезное увеличение микроскопа с «сухим» объективом.

Различают объективы для масляной и для водной иммерсии. Для первых в качестве иммерсионной жидкости используется специальное синтетическое масло, для вторых – дистиллированная вода. Можно использовать и другие жидкости, например глицерин или органическое масло, но разрешение картинки будет низким.

Иммерсионное увеличение микроскопа

Если на вашем микроскопе установлен обычный «сухой» объектив, не предназначенный для иммерсионного метода исследований, вряд ли его кратность превышает 40х. А верхний предел увеличения микроскопа, вероятно, находится около отметки в 1000 крат. Заменив «сухой» объектив на иммерсионный, вы сможете изучать структуры образцов на кратности в 2000х без падения качества картинки. Но почему это невозможно без иммерсии?

Согласно физическим законам полезное увеличение микроскопа, при котором детали образцов хорошо различимы, не может превышать значение числовой апертуры объектива более чем в 1000 раз. Числовая апертура «сухого» объектива обычно составляет 0,95–1. Даже если он будет 100-кратным, а окуляры 20-кратными, на максимальном увеличении вы увидите лишь размазанную картинку. Изображению не будет хватать четкости и яркости. Иммерсионный метод исследований позволяет раздвинуть эти пределы. Объектив погружают в иммерсионную жидкость, благодаря которой апертура объектива увеличивается, а значит, и улучшается разрешение картинки. На больших увеличениях иммерсионный микроскоп демонстрирует большую детализацию и контрастность изображения в сравнении с обычными световыми моделями.

4glaza.ru
Август 2017

Использование материала полностью для общедоступной публикации на носителях информации и любых форматов запрещено. Разрешено упоминание статьи с активной ссылкой на сайт www.4glaza.ru.

Производитель оставляет за собой право вносить любые изменения в стоимость, модельный ряд и технические характеристики или прекращать производство изделия без предварительного уведомления.

Источник

Иммерсия (микроскопия)

Иммерсия (иммерсионный метод микроскопического наблюдения) в оптической микроскопии — это введение между объективом микроскопа и рассматриваемым предметом жидкости для усиления яркости и расширения пределов увеличения изображения.

Иммерсионная система — оптическая система, в которой пространство между первой линзой и предметом заполнено жидкостью. Применяемая таким образом жидкость называется иммерсионной.

Содержание

Принцип действия

Из основной формулы разрешающей способности микроскопа: d = 0,61λ/А, следует, что предел разрешения определяется длиной волны λ и числовой апертурой объектива А. Так как не всегда возможно изменить длину волны (особенно если исследование производится в белом свете), то для достижения лучшего разрешения стремятся применять объектив, имеющий бо́льшую числовую апертуру.

Однако для «сухого» объектива, с показателем преломления среды перед его передней линзой n=1, максимальное значение числовой апертуры объектива не может превысить значение около 0,95.

Для решения этой проблемы берут иммерсионную жидкость, показатель преломления которой n₂ и показатель преломления фронтальной линзы n₃ выбраны определённым образом. Исходящие от одной точки объекта OP лучи проходят без преломления через иммерсионную пленку и могут «приниматься» фронтальной линзой объектива.

В этом случае числовая апертура увеличивается, а предел разрешения уменьшается в n₂ раз.

Дополнительные преимущества

Иммерсионные жидкости

В расчёте объективов микроскопа оптические параметры иммерсионной жидкости (показатель преломления и дисперсия) учитываются при коррекции аберраций оптической системы (исправление кривизны поля, сферических и хроматических аберраций).

Иммерсионное масло

В качестве первой иммерсионной жидкости применялось природное кедровое масло. Однако его главным недостатком было изменение свойств с течением времени. На воздухе жидкость постепенно уплотнялась, вплоть до осмоления и отвердения, показатель преломления менялся.

В XX веке начало производиться и ныне применяется исключительно синтетическое иммерсионное масло, не обладающее этим недостатком.

Считается, что первый серийный микроскоп с рассчитанным объективом масляной иммерсии появился в 1878 году.

Основные параметры иммерсионного масла стандартизованы.

По ГОСТ 13739-78 «Иммерсионное масло»: показатель преломления n_d = 1,515±0,001; коэффициент пропускания в слое толщиной 1 мм в спектральном диапазоне 500—720 нм — 95 %, 400—480 нм — 92 %. Иммерсионное масло должно применяться при температуре около +20 °C.

По Международному стандарту ISO 8036/1 «Иммерсионное масло»: показатель преломления n_е = 1,518 + 0,0005; коэффициент пропускания в слое толщиной 10 мм в спектральном диапазоне 500—760 нм — 95 %, 400 нм — 60 %.

По Международному стандарту ISO 8036-1/2 «Иммерсионное масло для люминесценции»: коэффициент пропускания в слое толщиной 10 мм в спектральном диапазоне 500—700 нм — 95 %, 365—400 нм — 60 %.

Некоторое отличие в стандартах означает, в частности, возможное ухудшение работы конкретного объектива с несоответствующим ему маслом. Результатом этого могут быть:

Водный раствор глицерина

Глицерин — применение в качестве иммерсионной жидкости нашёл благодаря пропусканию ультрафиолетового диапазона электромагнитных волн. Используется в виде водного раствора определённой концентрации. Первый объектив глицериновой иммерсии был рассчитан в 1867 году.

Используется дистиллированная вода. Считается, что впервые в серийный микроскоп рассчитанный объектив водной иммерсии был введён в 1850 году.

Коррекционные оправы

В конструкцию ряда иммерсионных объективов входят коррекционные оправы. Их установка определяет точное взаиморасположение линзовой системы объектива и покровного стекла. Наибольшее влияние точность задания этого взаиморасположения оказывает на компенсацию сферической аберрации оптической системы микроскопа.

На корпусе объектива обычно нанесена маркировка, показывающая:

Соответственно, на корректирующей оправе наносится конкретное значение, под которое скомпенсировано данное сочетание объектива и оправы. Смена корректировочных оправ требуется в следующих случаях:

Работа с разными жидкостями

Толщина покровного стекла

Работа со стандартным покровным стеклом (n = 1,52) требует корректировки и на толщину покровного стекла, если объектив рассчитан на водную (n = 1,33) или глицериновую (n=1,47) иммерсию. Такие аппараты имеют на корпусе буквенные метки, указывающие правильное положение коррекционного кольца для конкретного типа жидкости, а в пределах этой метки указываются толщины покровных стекол, для которых компенсация сферической аберрации минимальна.

История

Роберт Гук был первым учёным, объяснившим технику иммерсии в докладе «Lectures and Collections», прочитанном в 1678 году. Текст доклада был им напечатан в его книге «Microscopium» в том же году. Именно с этого события начинается история иммерсионных объективов.

Дэвид Брюстер в 1812 году предложил иммерсию как средство исправления хроматических аберраций объектива, и приблизительно в 1840 году Джованни Баттиста Амичи (1786—1868) изготовил первые иммерсионные объективы. В качестве иммерсионной жидкости применялись анисовые масла, так как их показатель преломления был наиболее близок к таковому для стекла.

Однако при этом не ставилась задача увеличения апертуры. Амичи понял эту проблему. Но из-за высокой стоимости предметных стекол микроскописты XIX века ещё не уделяли должное внимание масляной иммерсии. В результате он занялся водной иммерсией. В 1853 году он сконструировал водно-иммерсионный объектив и выставил его в 1855 году в Париже.

Роберт Толл (1820—1883) в 1858 году создал объектив с заменяемыми фронтальными линзами: одна — для работы в сухом состоянии, а другая — для водной иммерсии.

Эдмунд Хартнал (1826—1891) в 1859 году продемонстрировал свои первые водно-иммерсионные объективы с коррекционным кольцом. В последующие 5 лет он продал около 400 штук. Это породило целый бум производства объективов для водной иммерсии среди многих немецких производителей микроскопов, например Бруно Хазерта в Айзенахе, Келлнера в Вецларе, G&S Мерц в Мюнхене и Хугo Шродера в Гамбурге. Однако иммерсионные объективы Хартнала считались лучшими.

Париж. 1867 год. Эрнст Гундлах (1834—1908), желая использовать иммерсионную среду с бо́льшим показателем преломления, чем вода, сконструировал и представил на «Универсальной выставке» объектив для глицерина.

Оптические мастерские Цейсс в Йене изготовили в 1871 г. первые водно-иммерсионные объективы. И уже в 1872 г. Карл Цейсс внедрил водно-иммерсионные объективы Аббе. В тогдашнем каталоге Цейсса предлагались 3 объектива, которые все имели угол поля зрения 180°. Они имели различные рабочие расстояния, но постоянную числовую апертуру 1,0; объектив № 3 имел коррекционное кольцо, компенсирующее сферическую аберрацию.

В 1871 г. Толл представил новое открытие: для однородной (масляной) иммерсии он использовал иммерсионную среду Канадский бальзам, который имеет такой же показатель преломления, что и обычно используемое тогда стекло крон. В августе 1873 г. он изготовил трёхлинзовый объектив для однородной масляной иммерсии с числовой апертурой А = 1,25. Это достижение было признано рекордом для микроскопов. Но в том же месяце рассчитанный им объектив для глицериновой иммерсии достиг числовой апертуры А = 1,27.

С августа 1877 года Карл Цейсс начал изготовление масляно-иммерсионных объективов Aббe. Именно они стали наиболее известны как объективы для «масляной» иммерсии. В 1879 году, в докладе на Йенском медицинском и естественно-научном обществе Эрнст Аббе сообщил, что на созданную им концепцию масляно-иммерсионных объективов повлияла работа Дж. В. Стивенсона.

В 1879 году Эрнст Аббе подвёл итоги разработки иммерсионных систем и своих экспериментов в статье «Новые методы для улучшения сферической коррекции» (On New Methods for Improving Spherical Correction), опубликованной в журнале «Royal Microscopical Society». Главное сделанное им дополнение заключалось в том, что однородные иммерсионные системы позволяют получить максимальную апертуру при любых доступных оптических материалах.

Роберт Кох стал одним из первых исследователей, применивших масляно-иммерсионные объективы Аббе и систему конденсоров Аббе.

В 1904 г. предприятия Карл Цейсс изготовили 10-тысячный объектив для масляной иммерсии.

Источник

Иммерсионный микроскоп. Принцип работы. Сфера применения.

· применение иммерсионной смолы; (образует прослойку, с целью того, чтобы лучи не рассеивались и попадали в объектив)

· используется искусственное освещение;

· зеркало вогнутое, концентрирует световой пучок;

· объектив х90 – фронтальная линза малого диаметра, обладает большим увеличением ;

· находится несколько рассеивающих линз, предостеригающих абберации (искажения оптические и хроматические)

Преимущества: позволяет выделять отдельные структуры м/о

Недостатки: при окрашивании и фиксировании искажаются структуры м/о

Сфера применения: цитология, микробиология. Лабораторная диагностика

Фазово-контрастный микроскоп. Принцип работы. Сфера применения.

Фазово-контрастная микроскопия позволяет изучать живые и неокрашенные объекты за счет повышения их контрастности.

При микроскопии неокрашенных микроорганизмов, отличающихся от окружающей среды только по показателю преломления, изменения интенсивности света (амплитуды) не происходит, а изменяется только фаза прошедших световых волн.

Человеческий глаз этих изменений заметить не может, и наблюдаемые объекты выглядят малоконтрастными, прозрачными. Для изучения таких объектов используют фазово-контрастную микроскопию, основанную на преобразовании невидимых фазовых изменений световых волн в амплитудные, различимые глазом.

Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом световом микроскопе. Оно состоит из:

•набора объективов со специальными фазовыми пластинками;

•коденсора с поворачивающимся диском. В нем установлены кольцевые диафрагмы, соответствующие фазовым пластинкам в каждом из объективов;

Преимущества: клетки живые, не причиняем им вред

Недостатки: отдельные структуры изучить не можем (используется для живых м/о, в микологии, образовании споровых капсул)

Сфера применения: микробиология, лабораторная диагностика, гистология

Темнопольный микроскоп. Принцип работы. Сфера применения.

Темнопольная микроскопия основана на способности микроорганизмов сильно рассеивать свет. Для темнопольной микроскопи пользуются обычными объективами и специальными темнопольными парабалоид-конденсорами, центральная часть которых затемнена, так что прямые лучи от осветителя в объектив микроскопа не попадают. В объектив попадают только те лучи, которые отклоняются частицами препарата. Поэтому в темнопольном микроскопе микроорганизмы видны бесцветными на темном фоне.

Метод темнопольной микроскопии используется для изучения живых бактерий и их подвижности. При помощи этого метода могут быть обнаружены мельчайшие микроорганизмы, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности микроскопа. С помощью темнопольной микроскопии изучают нативные препараты типа «раздавленной» или «висячей капли».

Сфера применения: микробиология, лабораторная диагностика, гистология.

8.Люминесцентный микроскоп. Принцип работы. Сфера применения.

Люминесцентная микроскопия основана на способности многих веществ биологического происхождения и красителей светиться под действием падающего на них света.

Люминесцентная микроскопия увеличивает контрастность изображения, дает возможность различить отдельные клеточные структуры. Люминесцентная микроскопия применяется для бактериоскопии инфекционных возбудителей, для цитохимического исследования живых и фиксированных микроорганизмов. В РИФ с помощью антител, меченных флюорохромами, выявляются антигены микроорганизмов или антитела в сыворотке больных. РИФ используется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний.

Сфера применения: микробиология, лабораторная диагностика, гистология.

Дата добавления: 2019-02-26 ; просмотров: 1080 ; Мы поможем в написании вашей работы!

Источник

5 разных типов микроскопов и их применение

Как и многие другие технологические устройства, микроскопы имеют очень долгую историю. Самые ранние микроскопы содержали простое увеличительное стекло с малой мощностью (до 10 раз). Их использовали для наблюдения за маленькими насекомыми, такими как блохи.

Ранние версии оптических микроскопов были разработаны в конце 15 века. Хотя изобретатель неизвестен, за эти годы было сделано несколько заявлений. Использование микроскопов для исследования органических тканей появилось только в 1644 году.

Сегодня у нас есть микроскопы, которые могут обеспечить разрешение в 50 пикометров с увеличением до 50 миллионов раз, что достаточно для наблюдения ультраструктуры различных неорганических и биологических образцов.

1. Оптические микроскопы

Оптические микроскопы являются наиболее распространенными микроскопами, которые используют свет, чтобы пройти через образец для генерации изображений. Они могут иметь очень простую конструкцию, хотя сложные оптические микроскопы направлены на повышение разрешения и контрастности образца.

В дальнейшем их можно подразделить на два типа: простые и сложные микроскопы. Простой микроскоп использует одну линзу (например, увеличительное стекло) для увеличения, в то время как сложные микроскопы используют несколько линз для увеличения образца.

Они часто оснащены цифровой камерой, поэтому образец можно наблюдать с помощью компьютера. Это позволяет провести глубокий анализ микроскопического изображения.

Оптические микроскопы могут обеспечивать увеличение до 1250 раз с теоретическим пределом разрешения 0,250 микрометров. Тем не менее развитие сверхразрешенной флуоресцентной микроскопии в последнее десятилетие привело оптическую микроскопию в наноразмерность.

Варианты оптического микроскопа

Применение

Основные оптические микроскопы часто встречаются в классах и дома. Сложные широко используются в фармацевтических исследованиях, микробиологии, микроэлектронике, нанофизике и минералогии.

Они часто используются для исследования тканей с целью изучения проявлений заболеваний. В клинической медицине исследование биопсии или хирургического образца относится к гистопатологии.

2. Электронные микроскопы

Электронный микроскоп использует пучок ускоренных электронов для получения изображения образца. Точно так же, как оптические микроскопы используют стеклянные линзы, электронные микроскопы используют фасонные магнитные поля для создания систем электронно-оптических линз.

Поскольку длина волны электрона может быть намного короче, чем у фотонов, электронные микроскопы имеют более высокую разрешающую способность и увеличение, чем обычные оптические микроскопы. Они могут выявить структуры объектов размером с пикометр.

Первый электронный микроскоп, который превысил разрешение, достигнутое с помощью оптического микроскопа, был разработан немецким физиком Эрнстом Руской в ​​1933 году. С тех пор были сделаны многочисленные улучшения для дальнейшего улучшения увеличения и разрешения микроскопа.

Современные электронные микроскопы способны увеличивать образцы до 2000000 раз, однако они все еще полагаются на прототип Руска (разработанный в 1931 году) и его связь между разрешением и длиной волны.

Электронные микроскопы имеют некоторые ограничения: они дороги в изготовлении, обслуживании и должны быть размещены в стабильных средах, таких как системы подавления магнитного поля. Также объекты должны просматриваться в вакууме.

Современный просвечивающий электронный микроскоп | Предоставлено: Дэвид Морган из Кембриджа, Великобритания.

Два основных типа электронного микроскопа

1. Просвечивающий электронный микроскоп: используется для наблюдения за тонкими образцами, через которые могут проходить электроны, создавая проекционное изображение. Он может захватывать мелкие детали размером с колонку атомов.

В этом случае образец обычно представляет собой очень тонкий срез (

Современный сканирующий зондовый микроскоп

Распространенные типы сканирующих зондовых микроскопов

А) Атомно-силовой микроскоп: имеет разрешение порядка долей нанометра, что позволяет получать изображения практически любого типа поверхности, включая стекло, полимеры и биологические образцы.

B) Сканирующая оптическая микроскопия ближнего поля: может достигать производительности пространственного разрешения сверх классического дифракционного предела. Он может быть использован для изучения всех проводящих, непроводящих и прозрачных образцов.

C) Сканирующие туннельные микроскопы: могут достигать бокового разрешения 0,1 нм и глубины 0,01 нм. Образцы могут быть отображены в экстремальных условиях, при температурах от почти абсолютного нуля до более 1000 ° C.

Применение

Сканирующие зондовые микроскопы используются в широком спектре естественных наук, включая медицину, клеточную и молекулярную биологию, физику твердого тела, химию полимеров и полупроводниковую науку и технику.

Например, в молекулярной биологии этот метод микроскопии используется для анализа структуры и механических характеристик белковых комплексов и сборок. В клеточной биологии он используется для определения взаимодействия между определенными клетками и различения нормальных клеток и раковых клеток на основе твердости клеток.

В физике твердого тела он используется для изучения взаимодействия между соседними атомами и изменений в расположении атомов посредством атомных манипуляций.

4. Сканирующие акустические микроскопы

Сканирующий акустический микроскоп измеряет изменения акустического импеданса с помощью звуковых волн. Он в основном используется для неразрушающей оценки, анализа отказов и выявления дефектов в недрах материалов, в том числе обнаруженных в интегральных микросхемах.

Этот тип микроскопа был впервые разработан в 1974 году в микроволновой лаборатории Стэнфордского университета. С тех пор были сделаны многочисленные улучшения для повышения его точности и разрешения.

Микроскоп непосредственно фокусирует звук от датчика в маленькой точке на образце. Звук, падающий на объекты, либо поглощается, либо рассеивается под разными углами. Эти рассеянные импульсы, распространяющиеся в определенном направлении, дают полезную информацию об образце.

Разрешение образца изображения либо ограничено шириной звукового луча (зависит от частоты звука), либо физическим разрешением сканирования.

В отличие от обычных оптических микроскопов, которые позволяют наблюдать поверхность образца, акустические микроскопы фокусируются на определенной точке и получают изображения из более глубоких слоев. Кроме того, они обеспечивают более точные результаты и увеличивают объём данных, сохраняя при этом целостность образца.

Сканирующий акустический микроскоп Sonix HS 1000

Применение

Многие компании используют этот тип микроскопии в аналитических лабораториях для определения качества своих электронных компонентов. Производители также используют его для контроля качества, квалификации поставщиков, тестирования надежности продукции, а также для исследований и разработок.

В биологии эти микроскопы предоставляют полезные данные о физических силах, удерживающих структуры в определенных формах, таких как эластичность клеток и тканей. Это чрезвычайно полезно при изучении процесса подвижности клеток (способность организма самостоятельно передвигаться, используя метаболическую энергию).

5. Рентгеновский микроскоп

Рентгеновские микроскопы генерируют увеличенные изображения объектов, используя электромагнитное излучение в мягком луче. Они способны выдавать 3D-изображение компьютерной томографии относительно больших образцов с высоким разрешением.

Для идентификации рентгеновских лучей, проходящих через образец, используется детектор с зарядовой связью. Поскольку рентгеновские лучи легко проникают сквозь вещество, микроскопы этого типа могут отображать внутреннюю часть образцов, непрозрачных для видимого света.

Современные рентгеновские микроскопы позволяют наблюдать различные образцы, в том числе те, которые имеют низкий контраст поглощения и более плотный материал, например керамические композиты. Чтобы достичь этого, микроскоп изменяет длину волны рентгеновского излучения, что увеличивает контраст или проникновение.

Его разрешение лежит между оптической микроскопией и электронной микроскопией. В отличие от традиционных электронных микроскопов, рентгеновские микроскопы могут отображать толстые биологические материалы в их естественном состоянии.

Рентгеновский микроскоп ZEISS Xradia 510 Versa

Применение

Рентгеновская микроскопия оказалась чрезвычайно полезной в области медицины и материаловедения. Он был использован для анализа структуры различных тканей и образцов биопсии.

В области материаловедения рентгеновские микроскопы могут определять структуру кристалла вплоть до размещения отдельных атомов внутри его молекул. Он также обеспечивает неразрушающий, неинвазивный метод поиска дефектов в трех измерениях.

Источник