Что такое декальцинированная кость
Что такое декальцинированная кость
МБУЗ «Патологоанатомическое бюро», Таганрог
Декальцинация в гистологической лабораторной технике
Журнал: Архив патологии. 2012;74(6): 43-45
Пешков М. В. Декальцинация в гистологической лабораторной технике. Архив патологии. 2012;74(6):43-45.
Peshkov M V. Decalcification in histology laboratory techniques. Arkhiv Patologii. 2012;74(6):43-45.
МБУЗ «Патологоанатомическое бюро», Таганрог
Описана процедура декальцинации, которая может быть применена в любой гистологической лаборатории, работающей с костными образцами для общих и специальных целей. Рассмотрены преимущества и недостатки основных типов декальцинирующих агентов и принципы их выбора для разных типов объектов, а также методы определения окончания декальцинации.
МБУЗ «Патологоанатомическое бюро», Таганрог
Костные образцы считаются одними из трудных объектов для гистологического исследования, так как межклеточное вещество содержит избыток различных солей кальция. Минерализация обусловливает опорно-механическую функцию костной ткани, но именно это обстоятельство представляет известную трудность в практической гистологии.
Для рутинного гистологического исследования наиболее употребимыми являются фиксация в 10% нейтральном забуференном формалине, заливка в парафин и окраска гематоксилином и эозином. Образцы костной ткани требуют удаления кальция и изменения технологии получения парафиновых срезов. Чрезвычайно важным этапом в технологии изготовления гистологических препаратов является фиксация. Предпочтительное использование формалина для фиксации определяется следующими соображениями:
1) это самый часто используемый фиксатор; подавляющее большинство гистологических лабораторий используют один и тот же фиксатор практически для всех гистологических объектов;
2) любой из рутинных образцов может быть подвергнут иммуногистохимическому исследованию, а использование подавляющего большинства первичных антител требует фиксации материала в 10% нейтральном забуференном формалине.
Наличие солей кальция не позволяет приготовить срезы тканей на обычных микротомах, поэтому кальций необходимо удалить перед проводкой ткани (декальцинация). Этой процедуре подвергают не только костные образцы, но любые ткани, содержащие патологические участки обызвествления.
Ниже описаны детали процедуры декальцинации и способы контроля окончания декальцинации, пригодные для современной гистологической лаборатории.
Выбор декальцинирующего агента
Все декальцинирующие агенты можно условно разделить на кислотные и бескислотные.
P. Gray [6] приводит 65 рецептов декальцинирующих жидкостей, каждый из которых включает, как минимум, одну из кислот.
К бескислотным декальцинаторам относятся ионообменные смолы, но они не столь широко используются в гистологии.
Считалось, что для удаления кальция из компактных костей лучше всего подходят декальцинирующие жидкости на основе сильных минеральных кислот (соляная, азотная). Они действительно быстро извлекают кальций (2—3 сут), но такие объекты совершенно не пригодны для иммуногистохимического (ИГХ) исследования.
Считается, что губчатые кости лучше декальцинировать растворами на основе слабых органических кислот (муравьиная, уксусная), но и в этом случае могут возникнуть трудности при проведении ИГХ-окрасок. Процедура декальцинации слабыми кислотами занимает 7—10 дней и более.
В любом случае, когда в лаборатории исследуются опухоли костей и трепанобиоптаты костного мозга, нужно использовать растворы на основе этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) с рН 7,0. Если данная технология недоступна в лаборатории и используется метод декальцинации сильными кислотами, необходимо один репрезентативный кусочек опухоли вместе с костной тканью зафиксировать до процедуры декальцинации и сохранить его либо в 70% этаноле, либо в 70% изопропаноле, но не в формалине.
Выпиленные образцы толщиной 3 мм помещают в 10% нейтральный забуференный формалин на 24—48 ч при комнатной температуре в объеме фиксатора в 10—20 раз больше образца.
I. Dimmenstein [5] приводит описание некоторых приспособлений и вспомогательных приемов для вырезки костного материала. Перед проводкой избыток формалина отмывается в течение 20—30 мин в проточной воде.
Материал для декальцинации помещают в гистологические кассеты. Декальцинация каждого случая проводится в отдельной пластиковой емкости объемом не менее 200 мл, для контроля выбирают наиболее крупный образец. Процедура проводится без использования каких-либо приспособлений. Подогрев, мешалки, вакуум, микроволны, ультразвук и воздействие электрического поля могут изменить структуру белковых молекул и повредить антигены.
Объем декальцинатора по отношению к объему ткани должен быть, как минимум, в 50 раз больше, поскольку процесс извлечения происходит путем диффузии кальция в раствор. В свежем растворе декальцинация проходит сильнее. Необходимо заменять раствор на свежий ежедневно.
Определение окончания декальцинации
Это очень важный момент, так как он позволяет предотвратить необратимое разрушение тканей. Имеется несколько способов определения окончания процесса декальцинации.
1. Сгибание кусочка. Образец ткани пробуют согнуть пальцами. Пока в нем остается кальций, его очень трудно или невозможно согнуть, а при отсутствии кальция он легко гнется. Это быстрый и простой, но субъективный тест. При сгибании не полностью декальцинированной кости мягкие ткани могут отделяться от твердых, а также происходит повреждение структуры костной ткани. При слишком сильном сгибании ткани ломаются, даже если кальция в них уже нет [2, 11].
2. Проба образца тонкой иглой. Если игла проходит через образец без хруста, декальцинация считается законченной. При этом от иглы остаются следы, и это заметно под микроскопом. Нередко картина нарушается в самых ценных для диагностики местах. Тем не менее игла может проходить без затруднений и в тех случаях, когда в образце кальций еще остается в небольшом количестве [9].
3. Углекислотный тест. При помещении кусочка в декальцинирующую жидкость на поверхности раствора начинают появляться пузырьки углекислого газа. Отсутствие пузырьков газа свидетельствует об окончании процесса декальцинации. Это неточный тест, поскольку при наличии мелких кальцинатов пузырьки газа не визуализируются. Особенно трудно этот тест выполним на мелких костных фрагментах [10].
4. Всплывание образца на поверхность. Образец всплывает на поверхность, когда кальция в нем не остается. Это утверждение неверно, поскольку образец может всплывать независимо от наличия кальция или когда плотность образцов меньше плотности декальцинирующего раствора.
5. Оксалатный тест. Достаточно информативный и чувствительный метод [2, 4], который подходит для сильных и органических кислот, если их концентрация не превышает 10%. Он не подходит для растворов с ЭДТА. Продолжительность теста — 35 мин.
6. Рентгенографический метод. Впервые был описан в 1930 г. [7]. С помощью рентгеновского аппарата (обычного или специального, например, Faxitron) определяются даже минимальные количества кальция в исследуемом объекте. Можно определять отложения кальция и в парафиновых блоках [3]. Недостатки метода — дорогостоящая специальная аппаратура, а также влияние рентгеновского излучения на персонал. Преимущество — возможность тестирования большого количества объектов за короткое время.
7. Гравиметрический тест. Надежный тест, не требующий затрат реактивов, дорогостоящей аппаратуры и времени. Подходит для любого декальцинатора и любого объекта. Если масса объектов мала и они многочисленны, можно взвешивать их вместе. Исследуемый фрагмент промокают фильтровальной бумагой для удаления избытка воды и взвешивают его с точностью до миллиграмма. Массу фиксируют. В дальнейшем образец ткани после просушивания кусочками фильтровальной бумаги ежедневно взвешивают и сравнивают массу с предшествующим результатом. Пока удаляется кальций, масса образца будет убывать [1]. Имеется промежуток времени, когда масса остается постоянной. Как только кальций полностью будет удален, вода начинает замещать кальций, и масса образца начинает увеличиваться. Важно зафиксировать тот момент, когда кальций полностью удален из образца — декальцинация может считаться законченной [8]. После окончания декальцинации исследуемые образцы промывают в воде в течение 30—60 мин и начинают проводку по обычной схеме. Особенно важно выполнить промывку после использования жидкостей на основе ЭДТА, поскольку он при взаимодействии со спиртами образует осадки, значительно затрудняющие микротомию.
Определение момента окончания декальцинации является обязательным, но требует определенного навыка. Эти тесты рационально проводить на каком-либо одном (большем) образце от одного пациента, а не тестировать каждый объект.
Гравиметрический тест является наиболее быстрым, простым, удобным и дешевым. Для крупной лаборатории, постоянно работающей с костным материалом, целесообразно рассмотреть возможность приобретения портативной рентгеновской установки для тестирования момента окончания декальцинации. Оба метода оправдывают себя по затрате времени и простоте исполнения тестов, воспроизводимости и надежности результатов.
Возможность прерывания процесса декальцинации является неоспоримым преимуществом в случае, когда процесс близок к окончанию, а возможность завершить его отсутствует (выходные и праздничные дни, ночь и др.). В этом случае кусочки костей извлекают из декальцинирующего раствора, промывают в проточной воде в течение 20—30 мин и помещают в 10% нейтральный забуференный формалин на нужный срок. Возобновляют декальцинацию после извлечения образцов из фиксатора и промывки в проточной воде в течение 20—30 мин.
Обсуждение
Необходимо помнить, что декальцинации не подлежат хрящевые образцы, ткани с резко выраженным фиброзом, ногти, ороговевшая кожа и любые другие образцы, не содержащие солей кальция.
Декальцинирующие жидкости не обладают размягчающим действием и приводят к повреждению белковых структур. Декальцинаторы на основе минеральных кислот не могут применяться в тех случаях, когда может возникнуть необходимость в проведении ИГХ-исследований. Особенно это касается трепанобиоптатов костного мозга.
Поэтому группа декальцинаторов на основе сильных минеральных и органических кислот может использоваться только в тех случаях, например, когда нет подозрения на наличие опухолевого процесса, когда исследуют компактную кость.
Органические кислоты (муравьиная и ее соли, уксусная, трихлоруксусная, пикриновая, лимонная и ее соли) обладают более мягким действием, но требуют для полной декальцинации от нескольких дней до нескольких недель. В современных условиях, когда клиницисты требуют сократить сроки исследования, это вряд ли удобно.
Хелатирующие агенты (ЭДТА и ее соли) — отдельная группа декальцинирующих агентов. Механизм связывания кальция в зависимости от рН раствора можно представить следующим образом. ЭДТА связывает кальций в зависимости от рН за счет четырех карбоксильных кислотных групп (СООН) и двух аминогрупп (NH). При рН ниже 3,0 декальцинация не происходит вообще. При увеличении рН раствора протоны диссоциируют из этих групп. Этот процесс известен как депротонирование, и декальцинация становится возможной. При рН выше 10,0 группы СООН полностью депротонированы, эта форма ЭДТА быстро связывает кальций, и декальцинация происходит очень быстро. Однако при рН более 7,4 происходит необратимый щелочной гидролиз некоторых белков. При рН 7,0 декальцинация будет происходить достаточно эффективно. Детали эксперимента описываются в обзоре G. Callis, D. Sterchi [4].
К сожалению, в большинстве российских лабораторий чаще других используются декальцинаторы на основе сильных минеральных кислот (азотной, соляной), в которых концентрация кислот не превышает 10%. Более высокая концентрация не сокращает время извлечения кальция, а лишь ускоряет гидролиз белков ткани. Поэтому эта группа декальцинаторов подходит для извлечения больших масс кальция за короткое время, например для образцов компактной кости. Обычно время эффективного воздействия таких кислот ограничивается несколькими часами.
В формулах ЭДТА и ЭДТА с солями натрия более растворимы те, в которых больше натрия. Динатриевая соль ЭДТА менее растворима, чем тетранатриевая ЭДТА, но важно заметить, что их рН также отличаются.
Порошки ЭДТА, используемые для декальцинации, бывают нескольких видов.
А. ЭДТА (эдетовая кислота) имеет молекулярную массу 292 моль, она растворима в воде на 10%, концентрация ее полезна для декальцинации. Чтобы достичь высокой концентрации ЭДТА в растворе, ее нагревают и добавляют гидроксид натрия, который помогает «депротонировать» молекулу. Эта ЭДТА, растворенная в воде, имеет кислую рН (около 4,0) до добавки гидроксида натрия.
Б. Динатриевая соль ЭДТА имеет молекулярную массу 372 моль. 5% раствор имеет рН 4,0—5,0 при комнатной температуре. Соль растворяется в воде в концентрации до 10%, но при приготовлении раствора могут возникнуть трудности, пока рН раствора доводится до 7,0 с помощью гидроксида натрия. Наиболее часто применяется динатриевая соль ЭДТА, имеющая молекулярную массу 372,5 моль, раствор при комнатной температуре имеет рН 4,0—5,0:
вода дистиллированная, мл 850,0
ЭДТА динатриевая соль, г 125,0
натрия гидроксид, г 23,0.
Следует растворить динатриевую соль ЭДТА в воде, затем прибавить гидроксид натрия. Все процессы проводить, непрерывно помешивая. рН конечного раствора должен соответствовать 7,0, что достигается прибавлением по каплям 40% водного раствора гидроксида натрия, при помешивании и контроле рН с помощью предварительно откалиброванного рН-метра. Должен получиться совершенно прозрачный раствор, без каких-либо осадков и взвесей.
В. Тетранатриевая соль ЭДТА имеет молекулярную массу 380 моль и хорошо растворима в воде (14% или более), рН раствора 9,5—12,0. Эта молекула ЭДТА полностью «депротонирована», но высокий рН повреждает чувствительные к щелочам белки. При этом декальцинация будет очень быстрой, однако необходимо снизить рН уксусной кислотой до 7,4 (или до уровня, рекомендуемого для работы с ферментами) для гарантии качественных результатов при ИГХ-окрасках. Также рН можно снизить добавкой трис-гидроксиметиламинометана.
Приготовление растворов ЭДТА требует достаточного опыта, времени и четкого контроля рН с помощью рН-метра, что затруднительно в большинстве гистологических лабораторий. Поэтому целесообразно приобретать декальцинаторы, готовые к употреблению. Примерами могут служить Osteodec («Bio-Optica», Италия), бескислотный декальцинатор БМП («БМП», Россия) и др.
В итоге, находясь перед выбором декальцинирующего агента, лаборатория оказывается под влиянием следующих обстоятельств:
— неизвестно заранее, какой объект впоследствии будет подвергнут гистохимическому, иммуногистохимическому или молекулярному исследованию;
— клиницисты требуют выдачи результата в максимально короткие сроки;
— декальцинирующий раствор должен быть прост и эффективен, дешев и доступен и не повреждать элементы тканей.
По этим соображениям компромиссным представляется выбор декальцинатора на основе ЭДТА с нейтральной рН.
Заключение
Костные образцы, фиксированные в 10% нейтральном забуференном формалине, могут быть декальцинированы с использованием разных декальцинирующих жидкостей, но с обязательным контролем окончания декальцинации. Такой подход позволяет контролировать качество декальцинации ткани, которая впоследствии будет подвергнута как рутинным, так и ИГХ-исследованиям. Декальцинацию для таких случаев важно проводить растворами на основе солей ЭДТА с нейтральной рН. Если в данной лаборатории ИГХ-методы не выполняются, то макроскопически репрезентативный образец, зафиксированный в 10% нейтральном забуференном формалине, должен сохраняться в 70% этиловом или изопропиловом спирте до тех пор, пока не потребуется ИГХ-исследование. Это чрезвычайно важно для выбора лечебной тактики при гематологических заболеваниях и опухолях костной ткани.
Подготовка костного материала для гистологического исследования
код для вставки на форум:
ФИКСАЦИЯ КОСТНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
Первый этап обработки кусочков кости — фиксация, цель которой:
закрепить структуру костной ткани в том состоянии, в каком она находилась в момент ее погружения в фиксирующую жидкость;
предохранить ее от дальнейшего разрушения;
подготовить костную ткань к последующей обработке.
Для фиксации костной ткани наиболее пригодны фиксирующие жидкости, содержащие формалин, так как при последующей декальцинации меньше набухает ткань, содержащая коллаген. С целью выявления извести (солей кальция) в костной ткани в качестве фиксатора чаще всего используют этиловый спирт. Формалин, смеси с пикриновой кислотой й фиксаторы, содержащие трихлоруксусную и уксусную кислоты, обладают слабовыраженными декальцинирующими свойствами, что важно учитывать при фиксации кусочков костной ткани.
Продолжительность фиксации в каждом фиксаторе можно указать только примерно. Надрезая острой бритвой толстые куски фиксируемой ткани, по изменению окраски и плотности ткани можно удостовериться, полностью ли проник фиксатор в ткань. Не следует передерживать объекты в фиксаторах. Только в 10 % формалине и смеси Буэна кусочки костной ткани можно хранить неограниченно долго.
При работе с любыми фиксирующими жидкостями необходимо соблюдать общие правила фиксации, изложенные в главе 2.
Для фиксации костного материала используют формалин, зтиловый спирт, спирт-формол, жидкости Карнуа, Боуэна и др.
Формалин. Обычно используют:
Кусочки костной ткани фиксируют в течение 24—48 ч в хорошо укупоренной банке (материал в формалине может сохраняться годами), затем промывают в проточной воде (луч 2 сут) й проводят через спирты возрастающей концентрации.
Этиловмй спирт. Применяют как абсолютный, так й 96 «а спирт. Абсолютний спирт обладает преимуществом: благодаря резко выраженному коагулируюшему действию менее деформирует клеточные злементы. Но спирт имеет меньшую проникающую способность, чем формалин, поэтому кусочки костной ткани должны быть толщиной не более 0,5 см. Спиртовая фиксация, как правило, применяется в специальных случаях, например, для различных гистохимических методов й при исследований на соли кальция. 06’ьект помещают в спирт на 12—24ч, который за это время нужно 2—3 раза сменить.
Спирт с формалином (спирт-формол). Смесь готовят перед применением: 1 часть 10 % нейтрального формалина + 9 часте 96 % атипового спирта.
Кусочки кости фиксируют в течение 24 ч, а затем помещают в 96 % или 100 % спирт.
Жидкость Карнуа. Смесь содержит 6 частей 100 % спирт, З части хлороформа и 1 часть ледяной уксусной кислоты. Применение этой жидкости показано в тех случаях, когда необходимо ускорить исследование. Соединительная ткань при фиксации слегка сморщивается. Кусочки костной ткани толщиной 2 до 4 мм фиксируют от 2 до 3—4ч, а затем переносят в 100 спирт.
Жидкость Боуэна. Смесь готовят из насыщенного раствора пикриновой кислоты (15 частей), 40 % раствора формальдеги (5 частей) ледяной уксусной кислоты (1 часть). Жидкость быстро проникает в фиксируемые об’ьекты, визивая незначительное сморщивание соединительной ткани. Фиксацию проводят в течение 1 сут, затем кусочки тщательно промывают в проточной воде (не менее 24 ч) й проводят через спирты возрастающей концентрации, которые повторно меняют, чтобы, по возможности, устранить желтую окраску ткани.
Смесь сулемы с формалином. Эту фиксирующую смесь готовят из 9 частей насыщенного водного раствора сулемы 1 части 40 % формальдегида. Смесь считается очень хорошим фиксатором для органов, богатых соединительной тканью. Продолжительность фиксации в жидкостях 2—24 ч. При фиксации в жидкостях, содержащих сулему, в препаратах обычно образуются кристаллические или аморфные преципитаты. Для их удаления к 70—80 % спирту, служащему для промывания кусочков сразу же после фиксации, добавляют несколько капель 3 % спиртового раствора йодата калия. Материал выдерживают в зтом растворе 24 ч — ткань должна приобрести коричневый оттенок. Если кусочки обесцвечиваются, нужно увеличить в растворе концентрацию йода. Затем из материала удаляют йод при помощи 0,25 % раствора тиосульфата натрия й промывают в дистиллированной воде.
Фиксирующая смесь «Суза» по Гейденгайну. Вначале 4,5 г сулемы й 0,5 г хлорида натрия растворяют при нагревании в 80 мл дистиллированной воды, затем к раствору добавляют 2 г трихлоруксусной кислоты, 4 мл ледяной уксусной кислотьт й 20 мл 40 % формальдегида. Это одна из лучших фиксирующих смесей, одновременно обладающая декальцинирующим зффектом. Кусочки костной ткани, фиксируемой в смеси «Суза», должны быть не более 1 см. Фиксация продолжается от 3 до 24 ч в зависимости от величини исследуемого материала. Промывают материал в 96 % или 100 % спирте. Применение спирта меньшей концентрации нежелательно, так как при атом возможно чрезмерное набухание соединительной ткани. Далее кусочки обрабатывают в спиртовом йодо-йодокалиевом растворе.
Фиксирующая смесь «Супиформейс» по Пфулю. Смесь состоит из 40 мл концентрированного водного раствора сулемы, 20 мл 40 % формальдегида, 5 мл ледяной уксусной кислоты и 40 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты. Зта смесь обладает очень хорошими фиксирующими свойствами, применение ее не вызывает сморщивания исследуемого материала. Продолжительность фиксации кусочков костной ткани 12—24 ч. Затем следуют промвание в 80 % спирте и обработка в спиртовом йодо-йодокалиевом растворе.
Жидкость Гелли (ценкер-формол). Непосредственно перед применением к исходному раствору Ценкера вместо ледяной уксусной кислоты добавляют 5 мл формалина. Кусочки костной гкани фиксируют от нескольких до 24 ч, затем промывают в проточной воде в течение 24 ч.
Фиксирующая смесь «Саномия». Смесь состоит из 3 г сульфосалициловой кислоты, 5 мл ледяной уксусной кислоты й 100 мл 100 % спирта. Является очень хорошим общим фиксатозом, не вызывающим сморщивание материала. Смесь приготавливают непосредственно перед использованием. Фиксацию небходимо проводить в темноте в течение 3—12 ч, материал промывают в 100 % спирте.
ДЕКАЛЬЦИНАЦИЯ КОСТНОГО МАТЕРИАЛА
В период становлення гистологической техники для демонстрации применяли шлифованные распилы кости. Однако зтот метод оказался малопригодным для гистологических исследований, так как в зтих очень толстых срезах была плохо различима структура костной ткани й при шлифовапии разрушались клеточные элементы. Для получения гистологических срезов костной ткани необходимо растворить соли кальция, т.е. декальцинировать материал, сохранив клеточнь злемент й органический матрикс кости.
Декальцинацию проводят после полной фиксации ткани, обычно в некислых фиксаторах. После декальцинации в кислотах необходимо проводить деацидификацию с помощью щелочных растворов или по крайней мере путем промывания в двух сменах спнрта. Нельзя допускать длительного промывания в проточной воде, так как зто способствует набуханню коллагеновых волокон, особенно если промывание проводится сразу после обработки в кислых растворах.
При проведений декальцинации надо учитывать следующие положення.
В зависимости от используемых реагентов различают кислотную и бескислотную декальцинацию.
Кислотная декальцинация
Минеральный компонент костной ткани в основном представлен кристаллами нерастворимого гидроксиапатита. С тем чтобы удалить зто вещсство из кости, его псрсводят в растворимое состояние в декальцинирующих растворах, обладающих высокой кислотностью. Используются азотная, сернистая, муравьиная, трихлоруксусная, пикриновая кислоты й жидкости различного состана.
Азотная кислота. Для декальцинации применяют 5—7,5% водный раствор азотной кислоты. Для его приготовления в мензурку с притертой пробкой наливают 5—7,5 мл химически чистой концентрированной азотной кислоты (плотность 1,40) и добавляют до 100 мл дистиллированную воду. В оптимальных условиях небольшие кусочки самой плотной кости декальцннируются в растворе азотной кислоты уже через 10 ч. После декальцинации для подавления набухання соединительной ткани кусочки кости на 24 ч иодвешивают в 5 % растворе сульфата натрия или лития й лишь после зтого промывают в течение 24— 48 ч в проточной воде.
Не рекомендуется применять растворы азотной кислоты как более низкой, так н более высокой концентрации: в нервом случае происходит пабухание, во втором — повреждение клсточных структур. При этом в более концентрированном растворе кислоты значнтельно усиливается ее декальценирующее действие.
Сернистая кислота. Под воздействием сернистой кислоты нерастворимый в воде третичный фосфат кальция переходит в легко растворяющийся в воде первичный фосфат кальция. Для декальцчиации нспользуют насыщенный 5 % водный раствор серлисгой кислоты. Предварительную фиксацию кусочков кости лучше проводить формалином, а не растворами, содержащими сулему. Сернистая кислота обеспечивает быструю й рав-номерную декальцинацию в течение 5—8 дней.
Муравьиная кислота. Для декальцинации применяют концентрированную муравьиную кислоту, разбавленную равным количеством 70 % спирта или 10,— 15 % раствором формалина.
Материал перед зтим должен быть хорошо фиксирован в фор-малине. После декальцинации, кусочки кости промывают в те-чение нескольких дней в часто сменяемом 70 % спирте или 10— 15 % растворе формалина, что позволяет избежать сильного на-бухания тканей. Муравьиную кислоту особенно рекомендуют использовать для декальцинации зубов. Она мало влияет на окрашиваемость срезов костной ткани.
Трихлоруксусная кислота. Обычно применяют 5— 10 % вод-ный раствор этой кислоты, который одновременно фиксирует материал. К зтому раствору целесообразно добавлять 10—20 % раствор формалина. Декальцинацию в трихлоруксусной кнслоте рекомендуется проводить после предварительной фиксации в формалине, жидкости Боуэна. Для декальцинации небольших кусочков достаточно 1—4 дней. Материал промывают в 96 % спирте в течение 3—4 дней при ежедневной его смене. Для промывания ни в коем случае нельзя использовать воду, что приво-дит к очень сильному набуханню соединительной ткани.
Пикриновая кислота. Концентрированный водный раствор кислоты применяют для декальцинации змбриональных обьек-тов й костей мелких животных, поскольку процесе декальцинации в ней проходит очень медленно (от одного до нескольких месяцев). Материал промывают в 70—80 % спирте во избежа-ние набухання соединительной ткани, а также потому, что обра-зующиеся под воздействием пикриновой кислоты осадки боль-шей частью нерастворимы в воде. Клеточные структуры тканий способность окрашиваться сохраняются очень хорошо.
Жидкость Виленсона (кислотно-формалино-солевой раствор). Эта жидкость состоит из 10 % раствора азотной кислоты, приготовленного на 5 % формалине с добавлением ацетата калия из расчета 5 г на каждые 100 мл декальцинирующего раствора. Продолжительность декальцинацни в зтом растворе зна-чительно мепьше, чем в других реагентах, при зтом способность тканей окрашиваться не ухудшается.
Жидкость ван-Эбнера. Она имеет следующий состав: 10— 15 г хлорида натрпя, 2 мл соляной кислоты (плотность 1,19) й 100 мл дистиллированной воды. Декальцинирующее действие оказывает соляная кислота. Хлорид натрия главным образом противодействует разбуханию коллагеновых волокон. Кусочки кости оставляют в этой жидкости на несколько недель й даже месяцев, в течение которых нужно ежедневно добавлять 1-2 мл соляной кислоты для сохранения первоначальной концент-рации или ежедневно менять декальцинирующую жидкость. По окончании декальцинации кусочки промывают в проточной воде, затем переносят для нейтрализации в ежедневно сменяеымый 10—15 % раствор хлорида натрия.
Жидкость Рихмана—Гельфанда—Хилла. Данную смесь готовят из следующих компонентов: 90 % муравьиной кислоты (100 мл), 38,8 % соляной кислоты (плотность 1,19—80 мл), дистиллированной воды (820 мл). Кусочки костной ткани декальцинируют в этой смеси 1—5 дней при 20 °С й за 6—24 ч при 37 °С.
Жидкость Гудинга—Стеварта. Зта смесь состоит из 25 мл коннцентрированной муравьиной кислоты, 75 мл дистиллированой воды й 5 мл 40 % формальдегида. Декальцинация в этой смеси продолжается от 1 до 7 сут.
Флороглуциназотная кислота. Зта жидкость позволяет проводить быструю декальцинацию — в течение нескольких часов. Однако для тонких гистологических исследований предпочтительнее декальцинация в жидкости Гудинга—Стеварта. Кусочки костной ткани помещают в большой обьем декальцинирующей жидкости, которую готовят следующим образом: в фарфоровой чашке к 1 г флороглуцина медленно добавляют 10 мл концентрированной азотной кислоти. После прекращения кипения в чашку добавляют еще 100 мл 10 % азотной кислоти. Первоначально декальцинирующая жидкость имеет темно-красный цвет, но через несколько дней после приготовления становится желтой, что не свидетельствует о снижении ее зффективности. Флороглуцин защищает ткань от набухання й мацерации, которые наблюдаются при действии кислот.
Жидкость Дженкинса. Смесь состоит из 4 мл концентрированной соляной кнслоты,, 3 мл ледяной уксусной кислоты, 1 мл дистиллированной воды, 73 мл 100 % спирта й 10 мл хлороформа. Кусочки костной ткани декальцинируют в зтом растворе 2—4 сут при 20 °С. После декальцинации материал промывают в двух сменах 100 % спирта по 4 ч в каждой. Перед заливкой в парафин или целлоидин спирт удаляют в двух сменах хлороформа по 3 мин в каждой. После декальцинации в этом растворе не происходит набухання коллагеновых волокон, срезы костной ткани хорошо окрашиваются.
При проведений декальцинации в кислотных растворах крышку
банки, в которой находится декальцинирующая жидкость, необходимо держать слегка приоткрытой, что способствует улетучиванию углекислого газа. Удалять образцы из кислотных растворов необходимо сразу после прекращения формирования в жидкости пузырьков углекислоты. Чрезмерно длительное пребывание образцов костной ткани в кислотных растворах нежелательно, так как при атом ухудшается качество окраски срезов.
Бескислотная декальцинация
Бескислотные методы декальцинации возникли как альтернатива кислотной декальцинации, которая имеет ряд недостатков: повреждающее действие кислотных растворов на клеточные структуры, особенно при передержке в них материала; набухание межклеточного матрикса, в частности коллагеновых волокон; инактивация многих ферментов, в связи с чем почти невозможно проводить гистохимические и гистознзиматические исследования.
Бескислотная декальцинация рекомендуется в случае необходимости проведення гистохимических исследований костных образцов. эДТА й ее натриевые соли (версен, секвестрен, трилон Б, комплексон-ІІІ й др.) относятся к хелатообразующим агентам й имеют замечательное свойство: их растворм в комбинации с ионами кальция формируют легко растворимые отрицательио заряженнЫе комплексы кальция. При декальцинации в растворах эДТА не образуются пузыри газа, вследствие чего не по-вреждаются ткани. Использование эДТА й ее солей предотвращает нарушение окрашивания срезов декальцинированных костных образцов.
ЭДТА й ее соли рекомендуют использовать для декальцинации зубов й костей. Они с успехом могут быть применены для изучения щелочной фосфатазы й других ферментов (которые разрушаются в кислой среде при декальцинации), так как ЗДТА можно использовать при нейтральном рН.
ЗДТА й ее соли обычно используют в виде 5— 10 % водного раствора. Декальцинация проходит быстрее при ежедневной смене раствора. Щелочные растворы в некоторой степени гидролизуют белки, позтому рекомендуется применять растворы ЗДТА й ее солей в пределах рН 6,5—7,5. Губчатая кость в зтих растворах декальцинируется в течение 3—7 сут, компактная кость — намного дольше. На 1 г ткани необходимо брать приблизительно 100 мл декальцинирующей жидкости. После декальцинации кусочки тщательно промывают в проточной воде. Завершенность декальцинации чаще всего оценивают с помощью иголочного теста.
Приводим несколько известных методов бескислотной декальцинации хелатообразующими агентами.
Декальцинация версеном по Хиллеману—Ли. Смесь состоит из 5,5 % раствора версена, приготовленного на 10 % растворе формалина. Перед декальцинацией образцы в течение 24 ч фиксируют в нейтральном формалине. Декальцинирующий раствор обновляют каждые 10 сут. По наблюдению авторов, декальцинация большеберцовой кости крысы занимает в среднем 4 нед.
Декальцинация ЗДТА по Фрейману. Декальцинирующая жидкость представляет собой 5 % водный раствор ЗДТА, рН которого доведен с помощью гидроксида натрия до 6,0—6,5. Материал фиксируют в 80 % спирте в течение 24 ч при 4 °С, затем промывают проточной водой. Декальцинацию в первые 24 ч проводят при 4 °С, затем раствор заменяют й декальцинация продолжается при комнатной температуре в течение 2—21 сут. Раствор рекомендуют менять через равные промежутки времени.
Декальцинация трилоном Б. Декальцинирующий раствор состоит из 250 г трилона Б, 50 мл 40 % раствора гидроксида натрия й 1000 мл дистиллированной воды. В процессе приготовления раствора соблюдают следующую последовательность: 250 г трилона Б высыпают в огнеупорную стеклянную колбу, добавляют 200 мл дистиллированной воды, ставят колбу на пламя газовой горелки, добавляют 50 мл 40 % раствора гидроксила натрия, тщательно размешивают. Затем, не прекращая размешивания, добавляют 750—800 мл дистиллированной воды. С помощью 40 % раствора гидроксида натрия доводят рН до 7,4. Подогревание прекращают после полного растворения трилона Б. Повторно измеряют рН, добавляя при необходимости 40 % раствор гидроксида натрия.
Декальцинацию нежных образцов ткани, таких как улитка костного лабиринта пирамиды височной кости, желательно проводить после их заливки в целлоидин. Целлоидиновые блоки помещают в 3—5 % раствор азотной кислоты. После завершения декальцинации образцы в течение 24 ч обрабатывают 5 % водним раствором сульфата лития или натрия. Затем материал в течение 24 ч промывают в проточной воде с последующим обезвоживанием в спирте восходящих концентраций.
Критериями хорошей декальцинации костной ткани являются: 1) полное удаление солей кальция; 2) отсутствие в изучаемых срезах признаков разрушеиия клеток й соединительнотканных волокон; 3) отсутствие отрицательного влияния декальцинации на процессы окрашивания срезов костной ткани.
Факторы, влияющие на продолжительность декальцинации
2) температура, при которой протекает процесе декальцинации.
Концентрация активного агента. Применение различнх добавок, особенно буферов, защищающих ткани от повреждения, приводит к увеличению продолжительности декальцинации. В пределах определеннх ограничений более концентрированные растворы реагентов (особенно водные растворы кислот) действуют быстрее, но более вредны для обрабатываемых тканей. Известно, что в 4 н. растворе муравьиной кислоты декальцинация происходит вдвоє быстрее, чем в ином растворе, но 1 н. растворы соляной й трихлоруксусной кислот более зффективны, чем 4 н. Установление оптимальной концентраций активных реагентов является компромиссом, позволяющим добиться баланса между желаемым результатом декальцинации й нежелательным повреждающим действием на ткани.
Во всех случаях необходимо исключить значительное истощение активного декальцинирующего агента при его взаимодействии с кальцием. Позтому важно, чтобы соотношение обьемов
Температура. При увеличении температуры ускоряются многие химические реакции, включая декальцинацию костного материала, но при зтом усиливается воздействие кислот на обрабатываемую ткань. Так, при температуре 60 °С кость может полностью мацерироваться почти так же быстро, как декальцинироваться.
Оптимальная температура для кислотной декальцинации не установлена. Однако в большинстве случаев декальцинацию проводят при температуре рабочей лаборатории, хотя некоторые автори предлагают считать стандартной температуру 25 °С. В то же время при низкой температуре реакции замедляются, в связи с чем материал, декальцинируемый в конце рабочей недели, можно оставить в кислоте при 4 °С на 2—3 дня. Особенно зто полезно при использовании муравьиной кислоты.
Увеличение температуры также ускоряет декальцинацию, проводимую с помощью ЗДТА, но без риска мацерации. Обычно не определяются повреждения материала, декальцинированного с помощью ЗДТА при 60 °С при условии, что ткань была хорошо фиксирована.
Размешивание декальцинирующей жидкости. Вопрос о влиянии размешивания декальцинирующей жидкости на декальцинацию костной ткани спорные. В проведенных исследованиях не удалось подтвердить влияние зтого фактора на продолжительность декальцинации костной ткани. Вместе с тем большинство авторов рекомендуют перемешивать декальцинирующий раствор 1—2 раза в день.
Подвешивание декальцинируемого материала. Декальцинирующая жидкость должна свободно соприкасаться со всеми поверхностями ткани. Дно посуды, в которой находится декальцинирующий раствор, обычно покрывают стеклянной ватой или любым другим инертным абсорбирующим материалом. Кусочки ткани подвешивают на нитке, что обеспечивает смачивание обьекта декальцинирующей жидкостью со всех сторон. Желательно выполнять зту процедуру, так как даже при небольшом количестве образцов может стать невозможным проход между ними декальцинирующей жидкости, в результате чего увеличится продолжительность декальцинации.
Ионообменные смолы. L.W.DOTTI и соавт. (1951) описали метод использования ионообменных смол для ускорения декальцинации костной ткани, основаними на удалении из раствора
свободного кальция. Результаты сравнивались с данными, полученными при использовании 13 % раствора цитрата натрия в 45 % муравьиной кислоте. Установлено, что декальцинация с юмощью ионообменной смолы происходит быстрее, чем в контроле. При атом обеспечивается высокая сохранность ткани й клеточных деталей (кроме случаев, когда концентрация муравьиной кислоты превышала 50 %). Однако ^.М. іпуоосі (1958) не обнаружил каких-либо различий в длительности декальцинации или сохранности ткани при сравнении действия кислот эквивалентных концентраций с добавлением й без. добавлення ионнобменной смолы.
Злектролиз. С целью ускорения декальцинации І.М. КісЬ-пап й соавт. (1947) разработали электролитический метод. При том кость прикрепляют к аноду, злектрический ток, проходя через раствор злектролита, способствует миграции ионов кальция к катоду й тем самым вызывает деминерализацию кости. В качестве электролитов были испытаны разные растворы. Наиболее зффективной сказалась смесь 8 % соляной й 10 % муравьиной кислот (они сами по себе обладают выраженным десальцинирующим свойством), декальцинирующая костные образцы в течение 2—6 ч. Декальцинацию проводили при температуре от ЗО до 45 °С, но на аноде она была определенно выше.
Другие авторы, используя подобную аппаратуру й схожие растворы, обнаружили, что продолжительность декальцинации костных образцов составляет 15—20 ч. Более того, Е.С. Сіау-Іеп (1952) показал, что злектролитический метод пособствует незначительному ускорению декальцинации. Существенным недостатком этого метода декальцинации является риск повреждения (ожог, набухание или гидролиз) или деструкции ткани при ее контакте с электродом.
Завершение декальцинации
При наиболее оптимальном варианте ткань необходимо извлекать из декальцинирующей жидкости немедленно после того, как из кости удалены последние следы минералов. Для этого необходимо постоянно наблюдать за ходом декальцинации. В отдельных случаях допускается некоторая передекальцина-ция материала. При атом материал окрашивают так же, как й костный образец, в котором сохраняются последние остатки ми-нералов.
Контроль за ходом декальцинации осуществляют в сочета-нии с заменой декальцинирующей жидкости. При использова-нии в качестве декальцинаторов слабых кислот тестирование на завершение декальцинации обычно проводят ежедневно, при проведений декальцинации с помощью ЗДТА — еженедельно. Тестирование образцов костной ткани с небольшим содержани-ем минералов, декальцинацию которых осуществляют с помощью сильных кислот, проводится однократно для оценки пол-ной декальцинации материала. В тех случаях, когда обработку материала осуществляют в условиях значительного дефицита времени, допускается его неполная декальцинация.
Для контроля за завершением декальцинации используют различные тесты. Наиболее простыми являются сгибание или сжимание кусочков пальцами, пробный надрез, прокалывание кусочка препаровальной иглой. Для выполнения зтих тестов требу ется большой практический опыт, й ни один из них не может быть признан удовлетворительным, так как возможно повреждение материала, в частности при прокалывании кусочков иглой [Виноградова Т.П., 1964].
Химические тесты основаны на определении содержания кальция в декальцинирующей жидкости. Кальций-оксалатный метод позволяет обнаруживать в ней кальций за счет преципи-тации нерастворимых гидроокиси й оксалата кальция. Для проведення зтого теста берут приблизительно 3 мл использованной декальцинирующей жидкости, опускают в нее маленький кусо-чек лакмусовой бумаги й добавляют по каплям концентрирован-ный аммоний до тех пор, пока раствор не станет нейтральним (взбалтывают после добавлення каждой капли). Затем добавляют примерно 5 мл насыщенного раствора оксалата аммония, хо-рошо взбалтывают й оставляют на ЗО мин.
Образование преципитата после добавлення оксалата аммония свидетельствует о том, что в декальцинирующей жидкости имеется значительное количество кальция. Преципитация, по-ступающая после добавлення оксалата аммония, также позволяет сделать вывод о наличии кальция в декальцинирующей жидкости, но в меньшем количестве. Если исследуемая жидкость остается прозрачной в течение ЗО мин, то ато означает, что декальцинация завершена.
Зтот метод не применяют в тех случаях, когда декальцинирую-щая жидкость содержит свыше 10 % кислот. Однако такая жидкость может быть разведена или ее рН увеличен до 4,5 посредством добавления раствора гидроксида натрия непосредственно перед началом выполнения теста, но при зтом снижается чувствительность теста. Растворы муравьиной кислоты, концентрация которых выше 10 %, имеют тенденцию становиться мутными при проведений теста й обычно маскируют его результаты.
Процесе декальцинации кислотними жидкостями сопровожда-ется образованием диоксида углерода, покрывающим поверх-ность ткани слоем пузырьков. Они рассеиваются при встряхива-нии й образуются вновь до тех пор, пока в ткани присутствует карбонат кальция. Предлагалось использовать зтот показатель для оценки степени декальцинации, однако карбонат кальция со-ставляет только 4—5 % от общего количества всех минералов кости, позтому прекращение образования пузырьков углекислого газа не может быть надежным признаком полной декальцинации.
Несомненно, наиболее эффективным методом обнаружения кальция в ткани является рентгенография. С помощью стандартной клинической рентгенологической установки можно одномоментно исследовать несколько образцов.
Подрезание декальцинированного материала
Особым (завершающим) зтапом декальцинации является так называемое подрезание материала, т.е. окончательное моделирование кусочка кости перед его заливкой в избранную среду.
Необходимость в этом этапе бывает вызвана тем, что на поверхности кусочка кости (особенно губчатой) после пребывания его в кислотном декальцинаторе образуется слой (налет) жира костного мозга, содержащий костные крошки й нередко дере-вяшіые опилки. Налет жира удаляют, но при этом кусочек умсньшается в размерах, что нужно иметь в виду еще при выпи-лпвании образца. При работе с крупним фрагментом кости (из-готовление гистотопограмм) моделирование позволяет одновременно проверить полноту й качество декальцинации, избежать порчи микротомного ножа й получить качественные срезы. В случае неполной декальцинации ее приходится продолжить, таким образом, подрезание может быть неоднократным.
ПОСЛЕДУЮЩАЯ ОБРАБОТКА МАТЕРИАЛА
Декальцинированные в концентрированном нейтральном растворе ЗДТА ткани не помещают в 70 % зтиловый спирт, і как ато вызывает образование преципитатов в виде кристал, ческой корки из остатков ЗДТА й спирта. Для предотвращеі зтого дефекта Декальцинированные кусочки ткани после ЗІ на ночь помещают в раствор формалина.
При наличии не полностью обызвествленной ткани или в случаях, когда минеральные включення в ткани препятств получению удовлетворительных срезов, проводят поверхні ную декальцинацию. Минеральные включення выявляют по грубой (предварительной) резки ткани. В зтих случаях зали’ в парафин кусочек обычно помещают на 15—60 мин в 1 % сс ную кислоту так, чтобы кислота соприкасалась только с той верхностью блока, которую предстоит резать. Поскольку г никновение кислоти внутрь образца незначительное, блок д жен быть тщательно ориентирован в микротоме во избежаї потери декальцинированных срезов.
ЗАЛИВКА ДЕКАЛЬЦИНИРОВАННОГО МАТЕРИАЛА
Для приготовления гистологических препаратов декальцинированной костной ткани объект необходимо заключить в пластическую массу, способную полностью пропитать его и обеспечить консистенцию, позволяющую получать тонкие срезы. С этой целю используют заливку в парафин, целлоидин, целлоидин-парафин.
Для маленьких кусочков декальцинированной костной ткани вполне пригодна обычная заливка в парафин по общепринятой методике. В качестве просветляющего агента используют хлоро-
)рм, который хорошо растворяет парафин (позтому его при-меняют как промежуточную среду между обезвоживанием й за-ливкой тканії). С целью более качественного пропитывания костной ткани парафином заливку желательно осуществлять в вакууме. Для зтого образцы костной ткани, лежащие в смеси парафина с воском (3:1), помещают в вакуумную камеру (ваку-мный термостат) при температуре 37 °С. Давление в вакуумні камере снижают очень медленно до 400—500 мм рт. ст. родолжительность парафиновой заливки в вакууме обычно со-лвляет /^
/1 времени, необходимого для заливки таких же ютных образцов при атмосферном давлений. В заключение процедуры давление в вакуумной камере медленно повышают до тех пор, пока оно не сравняется с атмосферним. Костные об-
іщы больших размеров вакуумируют 2—3 раза, каждый раз іюмещая их в новую порцию парафина. При вакуумной заливке значительно ускоряется замещение хлороформа парафином.
Т.П. Виноградова (1973) предложила метод ускоренной парафиновой заливки, используемый в отдельных случаях для материала, полученного при аспирации или пункции.
1. Материал фиксируют в 10 % нейтральном формалине 1— Зч.
2. В случае необходимости проводят декальцинацию от 1 — 2 ч до 1 сут с последующим промыванием.
3. Переносят в 95 % зтиловый спирт — 2 смены по ЗО мин.
4. Проводят через 100 % спирт — 2 смены по ЗО мин.
5. Помещают в бензол на ЗО мин.
6. Заливают в парафин при 52—58 °С на ЗО мин.
Метод двойной целлоидин-парафиновой заливки
Зтот метод обладает достоинствами парафиновой й целлоидино-вой заливок. В срезах образцов, залитых с помощью зтого метода, ткани различной плотности (кость, хрящ й прилежащие мягкие ткани) удерживаются вместе лучше, чем при заливке в парафин.
і. Сухой целлоидин (10 г) растворяют в 1000 мл метилбензо-ла в закрытой колбе, которую необходимо встряхивать й пере-ворачивать 1—2 раза в день, 1—2 нед, иногда дольше.
2. Обезвоженные кусочки костной ткани помещают в полу-ченный раствор, который меняют через 24 или 48 ч, а при обра-ботке крупных обьектов — через 72 ч. В результате образцы становятся прозрачными.
3. Кусочки переносят в бензол (3 смены по 5—7 ч в каж-дой), после чего проводят по общепринятой методике через смесь, состоящую из равных частей бензол-парафина й чистого парафина.
Заливка в целлоидин
Целлоидиновая заливка незаменима при изготовлении гистоло-гических препаратов костной ткани. Целлоидин лучше связыва-ет друг с другом ткани разной консистенции, чем парафин, й предотвращает их разделение во время резки. Зтот способ заливки незаменим при получении гистологических срезов с боль-ших блоков кости (гистотопограмм) й кости с прилежащими мягкими тканями. В целлоидине кость становится более гибкой й близкой по плотности к заливочной среде. Корковое вещество кости меньше твердеет, чем при заливке в парафин. Для целло-идиновых срезов более пригодны некоторые методы окраски (например, метод выявления канальцев), кроме того, отдель-ные компоненты кости, такие как линии склеивания, выявляют-ся несколько лучше.
Целлоидиновая заливка имеет й недостатки. Так, из-за отно-сительно большой толщины получаемых срезов (10—20 мкм) затру днено изучение деталей клеток; возникают сложности при изготовлении больших й серийных срезов, их наклеивании на стекла; вследствие значительной продолжительности получения целлоидиновых срезов не всегда возможно их использование при исследованиях, проводимых с диагностической целью.
Заменителем целлоидина может быть ацетилцеллюлоза, по-лучаемая из негорючей кинопленки й рентгеновской пленки. Обработку й заливку кости в целлоидин проводят так же, как й мягких тканей, но заливочная среда должна быть более твер-дой. Некоторые исследователи предпочитают целлоидину низ-ковязкую нитроцеллюлозу, увеличивая тем самым твердость заливочной среды.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГИСТОТОПОГРАФИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
В практической й научной работе исследователей, специализи-рующихся в обпасти костной патологии, часто возникает необ-ходимость в сопоставлении тех или иных особенностей структури костной ткани в отдаленных друг от друга участках. Зту возможность предоставляют гистотопографические (кристелле-ровские) обзорные препараты. С их помощью можно оценить распространенность й выраженность патологического процесса в пределах всего или большей части органа [Смольянников А. В., Саркисов Д.С., 1994], в связи с чем легче сопоставить патомор-фологические й клинические проявлення болезни.
Для приготовлений гистотопографических срезов вырезают сравнительно тонкие (0,7—1 см) пластинки кости. Их после-дующая обработка включает:
Пропитаними целлоидином материал наклеивают на боль-:ие деревянные блоки. Срезы готовят на санном микротоме, крашивают обычными способами.
ПОЛУЧЕНИЕ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ СРЕЗОВ ДЕКАЛЬЦИНИРОВАННОЙ КОСТИ
Срезы с небольших кусочков декальцинированной костной ткани