Что такое гетерохроматин и эухроматин
Научная электронная библиотека
Юров И. Ю., Воинова В. Ю., Ворсанова С. Г., Юров Ю. Б.,
2.5. Гетерохроматин и эухроматин
Существует два основных типа хроматина: гетерохроматин и эухроматин. Данная классификация основана на ранних изучениях свойств хроматина в интерфазных ядрах, в которых содержится деконденсированный хроматин (эухроматин), распределенный диффузно и слабо окрашиваемый при использовании специфических гистологических красителей, а также конденсированные темноокрашенные блоки хроматина (гетерохроматин). В эухроматиновых участках хромосом локализовано подавляющее большинство генов, в то время как гетерохроматин,
по-видимому, содержит мало генов, которые обычно не активны. Выделяют два основных типа гетерохроматина: конститутивный и факультативный. Конститутивный гетерохроматин, который практически на протяжении всего клеточного цикла конденсирован, генетически не активен. Вероятно, последовательности ДНК, из которых состоит конститутивный гетерохроматин, практически не содержат генов. Этот тип гетерохроматина сформирован особыми классами высокоповторяющихся (сателлитных) последовательностей ДНК и расположен в участках центромер всех хромосом, а также в некоторых других ее участках. Факультативный гетерохроматин представляет собой инактивированные и конденсированные участки хромосом, которые могут обратимо переходить из эухроматинового в гетерохроматиновое состояние в зависимости от типа клетки, стадии клеточного цикла или особенности одной из гомологичных хромосом. Как правило, этот термин применяется для описания процесса инактивации хромосомы Х в клетках, которые содержат две и более хромосомы Х.
Сперматогенез. Всё, что вы хотели знать, но боялись спросить!
Сперматогенез. Всё, что вы хотели знать, но боялись спросить!
Автор
Редакторы
Статья на конкурс «Био/Мол/Текст»: Наш организм — это сложнейшая машина с многочисленными уровнями регуляции, но начиналось все когда-то всего лишь со слияния двух клеток: сперматозоида и яйцеклетки. Что же в них такого особенного, что вместе они способны дать начало новому организму? В этой статье мы поговорим про детство, отрочество и юность сперматозоидов, узнаем, какие трудности нужно пережить, чтобы стать одной из самых специализированных клеток организма, на примере сперматогенеза мышей.
Конкурс «Био/Мол/Текст»-2020/2021
Эта работа опубликована в номинации «Наглядно о ненаглядном» конкурса «Био/Мол/Текст»-2020/2021.
Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD.
Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.
Спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.
Перед тем, как разглядывать детали сперматогенеза, давайте взглянем на картину в целом [1]. Начнем совсем издалека — со строения генома. В нашем геноме 46 хромосом, из них 2 хромосомы половые (X и Y хромосомы), а остальные 22 пары — аутосомы. Это так называемый диплоидный набор — 2n. Он получается при слиянии яйцеклетки и сперматозоида, которые несут в себе гаплоидные наборы хромосом — n (22 аутосомы, по одной из каждой пары, и одну половую). Именно поэтому в каждом ребенке есть черты отца и матери. Изначально сперматогенез начинается со сперматогоний, исходных половых клеток с диплоидным набором хромосом (2n). Дальнейшие деления сперматогоний приводят к образованию сперматоцитов и именно сперматоциты вступают в мейоз, в результате которого образуются клетки с гаплоидным набором хромосом. Такие клетки называют сперматидами, они имеют круглую форму и внешне сильно отличаются от зрелых сперматозоидов. Поэтому в течение последней части сперматогенеза (ее еще называют спермиогенезом) происходит множество морфологических изменений и образуются зрелые сперматозоиды.
Однако есть еще пара важных вопросов, которые нам важно прояснить, прежде чем приоткрывать занавесу тайн сперматогенеза. В качестве модельного организма мы возьмем мышей, поскольку основные исследования по изучению сперматогенеза проводятся именно на них. И первый важный вопрос: а где же происходит вся эта вакханалия? Для сперматогенеза существует специальный парный орган — тестикулы (семенники). Внутри тестикул млекопитающих можно обнаружить семенные канальцы и межклеточное пространство. В тестикулах также присутствуют кровеносные и лимфатические сосуды, нервные клетки. В межклеточном пространстве обнаружены макрофаги, значительная часть которых находится на поверхности семенных канальцев.
Наиболее распространенным типом клеток, расположенных в межклеточном пространстве, являются клетки Лейдига, они секретируют тестостерон и другие андрогенные соединения. Эта функция важна тем, что способствует развитию вторичных половых признаков и обеспечивает нормальное течение сперматогенеза.
Семенные канальцы имеют U-образную форму, их внутренняя поверхность выстлана семенным эпителием, в котором протекает сперматогенез. Зрелые сперматозоиды попадают в просвет семенных канальцев, далее они направляются в средостение и затем накапливаются в эпидидимисе.
В семенном эпителии помимо половых клеток присутствуют клетки Сертоли, они окружают половые клетки, защищают их и обеспечивают питательными веществами. Плотные контакты между клетками Сертоли образованы мультибелковым комплексом, который прочно соединяет клетки друг с другом, в результате чего образуется гемато-тестикулярный барьер. Этот барьер отделяет клетки на поздних стадиях от кровеносных и лимфатических сосудов, что позволяет избежать аутоиммунной реакции. Подробности про гемато-тестикулярный барьер можно узнать в статье «Сперматогенез: через тернии к звездам» [2].
Теперь поговорим немного о том, что же мы хотим получить в конце нашего пути. Зрелый сперматозоид состоит из двух основных частей: это голова и хвост (флагелла) [1]. Отличительной особенностью сперматозоидов грызунов является крюкообразная голова, в то время как у копытных, плотоядных и приматов она округлая. В голове сперматозоида находится ядро, претерпевающее значительные изменения, о которых мы поговорим позже. Еще одним важным элементом, находящимся в голове сперматозоида, является акросома. Это мембранный пузырек с ферментами, который образуется из комплекса Гольджи. Его звездный час наступает при взаимодействии яйцеклетки со сперматозоидом: ферменты высвобождаются, растворяя оболочку яйцеклетки и помогая сперматозоиду проникнуть внутрь.
Для того чтобы добраться до яйцеклетки, у сперматозоида есть хвост (флагелла), который обеспечивает его подвижность [3]. Структурной основой флагеллы является аксонема — сложный комплекс на основе микротрубочек из белка тубулина. Микротрубочки образуют так называемую структуру 9×2+2: 9 дублетов микротрубочек располагаются по кругу, а в центе находятся две одиночные микротрубочки. От одного дублета к другому направлены динеиновые ручки, они обеспечивают скольжение дублетов относительно друг друга. Такое скольжение позволяет хвосту изгибаться в разных направлениях, в итоге его движение происходит по траектории, напоминающей воронку. С центральными микротрубочками дублеты связаны через белковые комплексы, которые называют радиальными спицами.
В хвосте сперматозоида на основе структурных различий выделяют несколько частей.
Самая ближняя к голове часть — соединительная. Именно в ней находится базальная пластинка, через которую происходит связь хвоста с головой.
За ней следует промежуточная часть, где находится митохондриальная спираль, состоящая из 50–75 митохондрий, вокруг которых вытягиваются 9 наружных плотных волокон. Митохондрии поставляют энергию для биения жгутика. Наружные плотные волокна представляют собой белковый комплекс, выполняющий структурную функцию. Промежуточная часть отделена от главной анулусом. Эта кольцевая структура помогает регулировать транспорт белков внутри хвоста.
В главной части уже нет митохондрий, снаружи появляется волокнистая оболочка, которая представляет собой две колонны. Колонны расположены вместо 3 и 8 наружных плотных волокон и соединены серией поперечных ребер. Колонны и ребра играют не только структурную функцию, предполагается, что они служат каркасом, на котором закрепляются ферменты, участвующие в регуляции созревания сперматозоида, подвижности хвоста и различных сигнальных путях.
Самой последней является концевая часть, где располагается аксонема и концы наружных плотных волокон и волокнистой оболочки.
Теперь мы вооружены и готовы начать наше путешествие! Первым делом познакомимся со сперматогониями — неспециализированными диплоидными клетками, с которых начинается сперматогенез.
Вначале было описано всего два типа сперматогоний [4], [5]. У первого, сперматогоний типа A, не обнаружили гетерохроматин в ядре, в то время как у второго, типа B, в ядре присутствовал гетерохроматин. Вскоре после этого был обнаружен тип сперматогоний с промежуточным количеством гетерохроматина — такие клетки были названы промежуточными (In) сперматогониями.
Что это значит для нас? Хроматин может находиться в активном состоянии или неактивном, активный хроматин мы называем эухроматином, а неактивный — гетерохроматином. Поскольку сперматогонии еще не определились со своей будущей профессией, то они себя не ограничивают и хранят генетический материал в активном состоянии. Однако решив стать зрелым сперматозоидом, сперматогония выбирает свой путь и знает, в каком направлении развиваться, поэтому всю ненужную для этого генетическую информацию переводит в неактивное состояние — гетерохроматин. Таким образом, увеличение количества гетерохроматина говорит нам об увеличении специализации клетки.
На данный момент обнаружено еще больше стадий, через которые проходят сперматогонии перед образованием сперматоцитов: от типа А через промежуточные в тип В [6]. Все начинается с деления сперматогоний As. Дочерние клетки могут мигрировать и стать двумя новыми одиночными стволовыми клетками, или могут оставаться вместе, соединенные межклеточным мостиком, поскольку цитокинез не завершен, и стать парой клеток Apr. Затем пара делится дальше, образуя цепочку из четырех. Затем сперматогонии Aal дифференцируются в так называемые сперматогонии A1, которые являются первым типом «дифференцирующихся» сперматогоний. У млекопитающих обычно шесть поколений дифференцирующихся сперматогоний делятся синхронно и на последнем своем делении производят сперматоциты.
Сперматогония типа В дает начало прелептотеновым сперматоцитам, которые вступают в мейоз, необходимый для получения гаплоидных клеток [7]. Мейоз состоит из двух последовательных клеточных делений без промежуточной S-фазы. Профаза первого мейоза удлинена и ее разделяют на последовательные стадии: лептотена, зиготена, пахитена и диплотена. Во время лептотены происходит конденсация ДНК, в зиготене гомологичные хромосомы соединяются и компактизируются. На стадии пахитены происходит кроссинговер — обмен участками между гомологичными хромосомами с образованием новых комбинаций генов. Этот процесс повышает наследственную изменчивость, благодаря которой происходит эволюция. В диплотене происходит частичная деконденсация хромосом и экспрессия генов, необходимых для дальнейших процессов. На этом профаза заканчивается. Далее хромосомы расходятся к полюсам клетки и результатом первого деления первичных сперматоцитов с диплоидным набором хромосом (2n) становятся вторичные сперматоциты с гаплоидным набором хромосом (n). При втором делении к полюсам клетки расходятся хроматиды, и после второго деления мейоза образуются круглые сперматиды.
Со стадии круглых сперматид начинается спермиогенез. Клетки больше не делятся, во время спермиогенеза происходит лишь усложнение их структуры, образуется хвост и сперматозоид приобретает знакомый нам вид [3].
Как мы уже знаем, круглые сперматиды образуются после мейотического деления сперматоцитов. Затем во время шага 2–3 аксонема начинает удлиняться и достигает почти полной длины. В это время она окружена жгутиковой мембраной — продолжением клеточной плазматической мембраны. Также во время стадии 2–3 на дистальном конце жгутика начинают формироваться предшественники колонн. Столбцы фиброзной оболочки и ребра впоследствии собираются в дистально-апроксимальном направлении — в том направлении, которое станет основной частью сперматозоидов. Между этапами 6 и 7 базальное тело с прикрепленной аксонемой перемещается к ядру и тянет за собой плазматическую мембрану, после чего плазматическая мембрана окружает промежуточную часть жгутика. На этапе 8 внешние плотные волокна начинают собираться вдоль дублетов микротрубочек аксонемы от промежуточной части к концу хвоста, в конечном итоге растягиваясь по всей длине, но не достигая своего полного диаметра до этапа 16. Также на этапе 8 из комплекса Гольджи образуется акросома. Параллельно с этим образуется манчета [8] — напоминающая юбку структура из микротрубочек и актиновых филаментов, играющая важную роль в транспорте белков из головы в хвост.
На этапе 9 ядро начинает удлиняться и конденсироваться, благодаря этому клетки на дальнейших стадиях называют элонгированными сперматидами. В обычном состоянии ДНК в ядре упакована с помощью белков гистонов, однако для более плотной упаковки гистоны замещаются на протамины [9]. Поскольку протамины несут больше положительных зарядов, отрицательно заряженная ДНК упаковывается еще более плотно, что позволяет уменьшить риск повреждения генетической информации до слияния сперматозоида с яйцеклеткой. Однако при такой плотной упаковке не происходит транскрипция, поэтому все необходимые РНК синтезируются заранее и хранятся в виде рибонуклеопротеиновых комплексов. Также на 9 стадии начинает формироваться анулус и окружает аксонему у ее основания. На шаге 15 анулус мигрирует дистально вдоль аксонемы к будущему месту соединения промежуточной и главной частей. Анулус представляет собой структуру в форме кольца, которая разделяет промежуточную и главную часть хвоста, тем самым участвуя в регуляции транспорта. В начале этапа 15 митохондрии в развивающейся промежуточной части мигрируют к аксонеме и конденсируются вокруг нее и внешних плотных волокон. На этапе 16 избыточная цитоплазма удаляется как остаточное тело. Затем зрелые сперматозоиды попадают в просвет и выходят из тестикул.
Зрелые сперматозоиды попадают в эпидидимис (придаток яичка). Сперматозоиды передвигаются за счет биения ресничек эпителия, при этом созревание сперматозоидов продолжается, они приобретают подвижность [10]. В итоге в эпидидимисе происходит накопление и хранение зрелых сперматозоидов. Около 23×10 6 сперматозоидов находится в эпидидимисе мышей, из которых 73% имеют нормальное строение, а остальные не пережили путешествие так успешно, и у них наблюдаются различные дефекты (отсутствие подвижности, наличие двух голов и т.д.).
В заключение хочется отметить, что различные поколения половых клеток связаны не случайным образом, а образуют клеточные ассоциации фиксированного состава. Так, например, сперматиды на данном этапе спермиогенеза всегда связаны с одними и теми же типами сперматоцитов и сперматогоний [11]. В определенный момент времени в семенном эпителии находится 3–4 типа клеток. В связи с этим у мышей выделяется 12 типов поперечных срезов семенного эпителия.
Научная электронная библиотека
Юров И. Ю., Ворсанова С. Г., Воинова В. Ю., Чурносов М. И., Юров Ю. Б.,
3.2. Гетерохроматин и эухроматин
Каждая хромосома человека дифференцирована на два типа различных участков: так называемые, эухроматиновые и гетерохроматиновые районы хромосом. Существует два основных типа хроматина: гетерохроматин и эухроматин. Данная классификация основана на ранних изучениях свойств хроматина хромосом человека в интерфазных ядрах, содержащих деконденсированный хроматин (эухроматин), распределенный диффузно и слабо окрашиваемый при использовании специфических гистологических красителей, а также конденсированные темно-окрашенные блоки хроматина (гетерохроматин). В эухроматиновых участках хромосом локализовано подавляющее большинство генов, в то время как гетерохроматин содержит мало генов, которые, по-видимому, обычно не активны. Выделяют два основных типа гетерохроматина: конститутивный и факультативный. Конститутивный гетерохроматин, который практически на протяжении всего клеточного цикла конденсирован, генетически не активен. Вероятно, последовательности ДНК, из которых состоит конститутивный гетерохроматин, практически не содержат генов. Этот тип гетерохроматина сформирован особыми классами высокоповторяющихся (сателлитных) последовательностей ДНК и расположен в участках центромер всех хромосом, а также в некоторых других ее участках. Факультативный гетерохроматин представляет собой инактивированные и конденсированные участки хромосом, которые могут обратимо переходить из эухроматинового в гетерохроматиновое состояние в зависимости от типа клетки, стадии клеточного цикла или особенности одной из гомологичных хромосом. Как правило, этот термин применяется для описания процесса инактивации хромосомы Х в клетках, которые содержат две и более хромосомы Х.
Научная электронная библиотека
3. АУТИЗМ И ГЕТЕРОХРОМАТИНОВЫЕ ВАРИАНТЫ ХРОМОСОМ
Поскольку при большинстве цитогенетических исследований в группе детей с аутизмом причину патологии в виде численных либо структурных аномалий хромосом обнаруживают в 5–10 % случаев или менее, очевидна необходимость поиска других структурных и функциональных изменений генома в качестве возможной причины аутистических расстройств (Ворсанова и др., 2006; 2008; Brothman et al., 2006).
Практически завершённая программа «Humаn Genоme» («Геном человека») (Venter et аl., 2001; IHGSС, 2004) оказалась неспособна расшифровать геномные последовательности в составе конституциональных гетерохроматиновых районов хромосом человека. Наиболее сложной и значимой проблемой является ответ на вопрос о корреляции вариабельности этих участков хромосом со специфическими фенотипическими проявлениями и о сложностях в дифференцировании так называемых нормальных вариаций гетерохроматиновых участков (гетерохроматиновые или хромосомные варианты) в структуре хромосом от их патологических изменений. Морфологические вариации хромосом за счёт этих участков поднимают вопрос об интерпретации хромосомных вариантов. Для ответа на этот вопрос необходимо знать многое о «нормальных»
вариантах хромосом, что было выполнено при их изучении во многих фундаментальных работах (Прокофьева-Бельговская, 1986; Жимулёв, 1993; Ворсанова и др., 1999; 2006; Wyаndt, Tоnk, 2004; Brоthmаn et аl., 2006). Неоценимый вклад в изучение нормальных хромосомных вариантов (С-вариантов) в различных популяциях внесли публикации 70-х годов, описывающие результаты сравнения групп детей негроидной и европеоидной рас по частоте экстремальных вариантов и гетероморфизма для каждой хромосомы. С-варианты хромосом 1, 9 и 16 встречались чаще, однако варианты в виде уменьшения блоков С-гетерохроматина статистически не различались у этих двух рас, а крупные С-варианты встречались почти в 2 раза чаще у негроидов. Также наблюдались и отличия по частоте инверсий гетерохроматина (1рhqh, 1рh, 9рhqh, 9рh). При Q-окрашивании различия частот определяли для коротких плеч и спутников акроцентрических хромосом, а также для ярко флюоресцирующих вариабельных прицентромерных участков хромосом 3 и 4. Отмечена высокая частота увеличения короткого плеча хромосомы 13 в группе представителей негроидной расы. Полиморфизма других хромосом эта методика дифференциального окрашивания не выявила. Отечественными исследователями также были изучены суммарные частоты экстремальных вариантов у 6000 новорождённых с помощью С- и Q-окрашивания. Общая частота комбинаций всех вариантов составила 12,8 на 1000 новорождённых (Кулешов, Кулиева, 1979).
В целом, вариабельность гетерохроматиновых участков хромосом наблюдают:
а) при С-окрашивании – в хромосомах 1, 9, 16, 13–15, 21, 22 и Y;
б) при Q-окрашивании – в хромосомах 3, 4, 13–15, 21, 22 и Y.
Изредка могут встречаться гетерохроматиновые варианты других хромосом.
Многие группы исследователей анализировали хромосомные варианты в различных группах и популяциях. Отдельные варианты встречаются чаще в одних популяциях, чем в других, однако разная степень качества препаратов, методов окрашивания, степень конденсации гетерохроматина усложняют прямое сравнение частот вариантов хромосом, выявленных различными группами исследователей. Как правило, хромосомные варианты встречаются с частотой 1 % и выше, хотя варианты некоторых хромосом обнаруживаются крайне редко (например, варианты хромосом 8 или 20 встречаются в единичных случаях). Во многих работах отмечено увеличение частоты гетерохроматиновых вариантов при психических расстройствах, в частности, при аутизме (Ворсанова и др., 2008; Демидова и др., 2012; Кравец и др., 2014).
В проведённых в 70-е годы популяционных исследованиях часто не отмечалась зависимость уровня интеллекта от наличия Q- и С-полиморфизма, однако уже тогда стали поступать различные сообщения об увеличенной частоте С- и Q-вариантов в группах лиц со сниженным интеллектом, с шизофренией, гиперактивностью, задержкой психоречевого и психомоторного развития (Ibrаimоv et аl., 1982, 1986). Некоторые исследователи предполагали корреляцию между длиной хромосомы Y и агрессивностью поведения, основываясь на том, что при изучении больших групп мужчин – заключённых тюрем увеличение её длины отмечалось статистически достоверно чаще. Но эти предположения довольно спорны, поскольку, как показывает многолетняя цитогенетическая практика, увеличение длины хромосомы Y происходит в большинстве случаев за счёт гетерохроматинового участка в длинном плече этой хромосомы, что не так уж редко отмечается и при изучении контрольных групп, а случаи перестроек, затрагивающих эухроматиновые последовательности хромосомы Y, довольно редки и чаще сопровождаются нарушениями половой сферы пациентов при сохранном интеллекте (Демидова, Ворсанова, 1990).
Анализируя доступные литературные данные, сложно сделать однозначный вывод о возможной связи между вариациями гетерохроматиновых участков хромосом и нарушениями психики. Публикации в этой области есть, но их мало, и очевидна актуальность проведения таких исследований в различных группах, включая индивидуумов, страдающих нервно-психическими заболеваниями.
Говоря о нервных и психических заболеваниях, необходимо упомянуть и о факультативном гетерохроматине, который, в частности, формируется в случае инактивации хромосомы Х у млекопитающих (Lyоn, 1961). В определенных случаях эухроматиновые участки могут обладать некоторыми свойствами гетерохроматина. Такие участки более конденсированы по сравнению с R-сегментами хромосом, и их экспрессивная активность меньше. Описываемый феномен (называемый «феномен гетерохроматинизации») связан с тем, что ДНК эухроматина, располагаясь около гетерохроматина, может приобретать свойства последнего и, находясь в конденсированном состоянии, частично утрачивать активность. Этот процесс обратим, контролируется определёнными генами и характерен для хромосом Х, которые инактивируются почти по всей длине в раннем эмбриогенезе. Этот эпигенетический феномен в сомаических клетках женщин выравнивает количество продуктов активных генов хромосомы Х у лиц женского и мужского пола (компенсация дозы гена) при развитии тканей и органов (Ворсанова и др., 2008; Lyоn, 1961; Рlаth et аl., 2002; Сhоw, Brоwn, 2003; Heаrd, Disteсhe, 2006; Lee, 2009).
Как известно, женский кариотип содержит 2 хромосомы Х, а мужской – хромосомы X и Y. Возникает несоответствие содержания генетической информации в гоносомах организмов разных полов. У человека, как и у всех млекопитающих, такое нарушение баланса устраняется с помощью инактивации одной из хромосом Х во всех клетках женского организма. Первые предположения об этом феномене были высказаны Лайон в 1961 г. после опытов на мышах, где изучались конденсированные структуры хроматина. Этот феномен был охарактеризован как «транскрипционное молчание одной их хромосом Х у самок млекопитающих», и именно с помощью него достигается межполовая компенсация экспрессии генов хромосомы Х (Lyоn, 1961). В таких клетках образуется исключительно стабильная гетерохроматиновая структура (инактивированная хромосома Х). Мозаичная экспрессия материнских и отцовских аллелей локусов хромосомы Х отмечается у большинства лиц женского пола. В среднем, каждая из них принимает участие в экспрессии примерно в 50 % клеток, но, поскольку процесс инактивации случаен, он может значительно варьировать, что называют сдвигом Х-инактивации. Причинами сдвига инактивации считают импринтинг, структурные аномалии хромосомы Х, а также мутации Х-сцепленных генов (Оrstаvik, 2009; Аgrelо, Wutz, 2010) и мозаицизм типа 45,Х/46,ХХ. С явлением случайной, или неравной, инактивации хромосом Х в клетках женского организма ассоциируют вариации факультативного гетерохроматина и патогенез различных наследственных заболеваний. Отклонение от равного соотношения количества клеток с активной материнской или отцовской хромосомой Х и преобладание одной из клеточных популяций может вызываться мутациями хромосомы Х с последующим отбором в пользу клеток, несущих мутации в инактивированной хромосоме Х (Rаymоnd, 2006). Некоторые состояния связывают с неравной Х-инактивацией, в том числе мультифакторные заболевания (аутизм, аутоиммунные заболевания, онкологические состояния). Это эпигенетический феномен имеет большие перспективы в дальнейших научных исследованиях.
В исследованиях различных групп детей с аутизмом (Саstermаns, Wilquet,, 2004) по сравнению с общей популяцией отмечено значительное увеличение встречаемости различных хромосомных, или гетерохроматиновых вариантов, в частности таких как 1рhqh, 9qh+ и 16qh-, что, вероятно, можно рассматривать как эффект положения генов (Ворсанова и др., 2008).
В одном из ранних наших исследований проведён цитогенетический и молекулярно-цитогенетический анализ 90 детей с признаками аутизма и их 18 матерей (Ворсанова и др., 2009 а, б). Репрезентативную основную группу составили 13 девочек и 77 мальчиков. В исследуемой группе возраст варьировал в пределах от 1 до 15 лет (средний возраст – 6,5 лет), возраст матерей – от 24 до 41 года (средний возраст – 32 года). Дети, у которых наблюдались умственная отсталость, сцепленная с ломкой хромосомой Х, синдром Ретта и другие моногенные синдромы, не были включены в исследование. Умственная отсталость наблюдалась у 88 из 90 детей с аутизмом (98 %). В контрольную группу был включен 51 ребёнок без аутистических расстройств – 23 девочки и 28 мальчиков в возрасте от 1 до 15 лет (средний возраст – 5,5 лет). Диагноз «аутизм» установлен у всех пациентов на основании DSM-IV. Тяжесть симптомов оценивали количественно с помощью шкалы САRS (Sсhорler et аl., 1993), как уже отмечалось, включающей в себя анализ следующих областей: коммуникация, подражание, моторное развитие, адаптация к изменениям, игровая деятельность, зрительный контакт, реакция на тактильные и слуховые раздражители, вербальная и невербальная коммуникативная активность, эмоциональное общение, страх и нервозность, уровень активности, дезинтеграция развития разных психических сфер, общее впечатление. Тяжесть патологических проявлений оценивали от 1 до 4 баллов, после чего баллы суммировали. Состояние детей оценивалось как тяжелое. Всем исследуемым детям был проведен анализ при помощи С-окрашивания хромосом и количественной флюоресцентной гибридизации in situ (QFISH). С помощью этих методов было показано достоверное увеличение частоты вариаций гетерохроматина у детей с аутизмом по сравнению с контрольной группой (48 и 16 %, соответственно). В молекулярно-цитогенетических исследованиях применяли FISH и хромосомоспецифичные ДНК пробы, маркирующие вариабельные участки перицентромерного гетерохроматина хромосом 1, 9, и 16. Детекция флюоресцентных сигналов проводилась с помощью системы компьютерного анализа изображения. В результате этих исследований кроме аномалий хромосом у 43 детей (48 %) также были обнаружены изменения размеров гетерохроматиновых участков в виде их уменьшения, увеличения и инверсий, среди которых 1рhqh у 6 (7 %), 9рhqh у 7 (8 %), 9qh + у 3 (3 %), 9qh- у 1 (1 %), 16qh + у 1 (1 %), 16qh- у 3 (3 %), другие варианты у 5 (6 %), сочетанные варианты у 18 (20 %). При расчётах по каждому варианту учитывались как изолированные, так и сочетанные случаи. Также цитогенетически обследованы 18 матерей, среди них гетерохроматиновые варианты хромосом выявлены у 9, причём в 5 случаях эти варианты были унаследованы их детьми. Молекулярно-цитогенетическое исследование вариантов этих хромосом с помощью QFISH полностью подтвердило данные цитогенетического анализа и позволило оценить число копий ДНК при перицентрических инверсиях с увеличенным гетерохроматиновым блоком (1рhqh+ и 9рhqh+) (Iourоv et аl., 2005).
Следует сказать о последних исследованиях гетерохроматиновых районов хромосом при аутизме, проведенных в наших лабораториях: лаборатории молекулярной цитогенетики нервно-психических заболеваний ОСП Научно-исследовательского клинического института педиатрии ГОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, лаборатории цитогенетики и геномики психических заболеваний, а также лаборатории генетики мозга ФГБНУ Научный центр психического здоровья, которые представлены ниже.
В работе исследовали гетерохроматиновые участки (С-варианты) отдельных хромосом, выявляемые с помощью стандартного метода С-окрашивания, у 204 детей с аутизмом. У 110 пациентов из 204 обследованных (53,9 %) выявлено изменение гетерохроматиновых участков хромосом (С-вариантов), что представлено на рис. 5.
Рис. 5. Выявление С-вариантов гетерохроматина в группе детей с аутизмом
Большая доля (более половины) гетерохроматиновых вариантов в группе детей с аутизмом по сравнению с 4–6 % в общей популяции может предполагать возможное участие этих вариантов в патогене-
зе аутизма.
Всего нами выявлено 189 вариантов (0,92 варианта на индивидуума). Изолированные варианты были обнаружены в 81 случае (39,7 %). Сочетанные варианты обнаружены в 52 случаях (25,5 %). Наиболее часто встречающиеся варианты (изолированно и в сочетании с другими) представлены в таблице ниже (табл. 5).
Удельный вес различных гетерохроматиновых вариантов (изолированных и сочетанных) представлен на рис. 6 (проценты вычислены от числа случаев с вариантами хромосом – n = 110).
Наиболее часто встречающиеся гетерохроматиновые варианты (изолированные и сочетанные) в группе детей с аутизмом
Число пациентов с данным вариантом (доля от общего числа пациентов в процентах)
Число пациентов с сочетанными вариантами (включая данный)