Что такое питательные среды для клеток и тканей

Питательная среда

Содержание:

Питательные среды

Виды питательных сред

По составу питательные среды делят на:

По целевому назначению питательные среды делят на:

По физическому состоянию питательные среды делят на:

Культура бактерии Xanthomonas axonopodis

Селективная питательная среда [5]

Требование к питательным средам

Для культивирования микроорганизмов используют различные по составу питательные среды. Но все они должны соответствовать ряду общих требований:

Потребность в сере удовлетворяются сульфатами. В фосфоре – солями фосфорной кислоты. Все необходимые металлы и прочие элементы – в форме катионов или анионов неорганических солей. В частности, источник магния – сульфат магния (MgSO₄), натрия – хлорид натрия или поваренная соль (NaCl), кальция – хлорид кальция (CaCl₂) или карбонат кальция (CaCO₃).

Использование питательных сред

Питательные среды используются для:

Источник

Питательные среды в микробиологии

Питательные среды в микробиологии — это субстраты, на которых выращивают микроорганизмы и тканевые культуры. Они применяются для диагностических задач, выделения и изучения чистых культур микроорганизмов, получения вакцин и лекарств, для других биологических, фармацевтических и медицинских целей.

Классификация микробиологических питательных сред

В микробиологии питательные среды разделяют на:
— среды определенного и неопределенного состава;
— натуральные, полусинтетические и синтетические;
— основные, диагностические, элективные;
— плотные, полужидкие, жидкие, сухие, сыпучие.

Натуральными питательными средами называют те, что получают из природных материалов: крови, мяса, белков, органов животных, растительных экстрактов и растительного сырья. Примером таких сред могут быть мясной бульон, молочная сыворотка, пивное сусло, настои сена, агар-агар, кровь, желчь. Натуральные среды относятся к средам с неопределенным составом, который в разное время могут иметь разное количество тех или иных компонентов.

Полусинтетические среды тоже считаются средами с неопределенным составом. Они готовятся на основе натуральных питательных сред, но в них добавляются вещества, которые гарантируют культурам активное размножение. На полусинтетических средах выращивают культуры для получения витаминов, аминокислот, антибиотиков в промышленной фармацевтике.

Синтетические среды готовят из ингредиентов известного состава, в известной концентрации и соотношениях, поэтому эти среды относятся к средам определенного состава. С их помощью изучают метаболизм микроорганизмов, их биологические и физиологические свойства, возможность получения веществ, подавляющих или, наоборот, стимулирующих их развитие.

Основные, элективные и диагностические питательные среды

Основные среды служат для выращивания различных микробных культур, а также как основа для получения элективных и диагностических сред. К основным средам, например, относится мясной бульон, мясной агар, сусло, бульон Хоттингера. Для разных культур в основные среды добавляют некоторые компоненты для стимулирования роста — это могут быть витамины, аминокислоты, природные экстракты. Так, возбудитель коклюша выращивается на среде с добавлением крови.

Элективные среды — среды для избирательного (селективного) выращивания биологических культур. Состав среды подбирается так, чтобы быть оптимальным для одного вида или группы близкородственных бактерий и подавлять развитие бактерий других видов. Например, добавление в среду хлористого натрия в определенной концентрации подавляет рост всех бактерий, кроме стафилококков. С помощью элективных культур получают чистые культуры для дальнейшего размножения и накопления.

Диагностические среды служат для идентификации микроорганизмов. По изменению среды и ее химического состава (изменению окраски среды, появлению пузырьков газа и т.п.) определяют вид бактерий. В такие среды часто добавляют химические красители-индикаторы, такие как кристаллический фиолетовый, малахитовый зеленый, метиленовый синий, фусин и другие. Они помогают разделить близкие культуры. Скажем, в розовой среде Эндо, подкрашенной фусином, кишечная палочка образует колонии красного цвета, а тифозные и дизентерийные колонии бактерий — бесцветные.

Источник

Клеточная инженерия. Клетки и ткани, методы культивирования

» data-shape=»round» data-use-links data-color-scheme=»normal» data-direction=»horizontal» data-services=»messenger,vkontakte,facebook,odnoklassniki,telegram,twitter,viber,whatsapp,moimir,lj,blogger»>

Клеточная инженерия. Клетки и ткани, методы культивирования

Клеточная инженерия — одно из наиболее важных направле­ний в биотехнологии. Она основана на использовании принципи­ально нового объекта — изолированной культуры клеток или тка­ней эукариотических организмов, а также на тотипотентности — уникальном свойстве растительных клеток. Применение этого объекта раскрыло большие возможности в решении глобальных теоретических и практических задач. В области фундаментальных наук стало осуществимым исследование таких сложных проблем, как взаимодействие клеток в тканях, клеточная дифференциров-ка, морфогенез, реализация тотипотентности клеток, механизмы появления раковых клеток и др. При решении практических задач основное внимание уделяется вопросам селекции, получения зна­чительных количеств биологически ценных метаболитов расти­тельного происхождения, в частности более дешевых лекарств, а также выращивания оздоровленных безвирусных растений, их клонального размножения и др.

КУЛЬТУРА КЛЕТОК И ТКАНЕЙ, КРАТКАЯ ИСТОРИЯ ПРЕДМЕТА

Бурное развитие клеточной инженерии приходится на 50-е годы прошлого века, хотя первые попытки выращивания изолированных кусочков ткани были сделаны гораздо раньше. В конце XIX — начале XX в. немецкие ученые X. Фехтинг (1892), С. Рехингер (1893), Дж. Хаберландт (1902) сделали первую неудачную попытку стимуляции роста растительных тканей и органов, помещенных на фильтро­вальную бумагу, пропитанную сахарозой. Несмотря на отсутствие положительного результата, их работы представляют большой инте­рес. В них были высказаны идеи, которые намного опередили раз­витие науки того времени и которые нашли свое подтверждение несколько десятилетий спустя. Так, Фехтинг предположил, что полярность присуща не только организму или органу растения, но и самой клетке. Рехингер определил минимальный размер сег­мента, образующего каллус. Согласно его исследованиям, в кусоч­ках ткани тоньше 1,5 — 2,0 мм клетки не делились. Хаберландт впервые четко сформулировал идеи о возможности культивирования in vitro изолированных клеток растений и о тотипотентности кле­ток, т. е. способности любой соматической клетки полностью реализовывать свой потенциал развития. Иначе говоря, о способнос­ти каждой растительной клетки давать начало целому организму.

Первые успехи были получены в 1922 г. американским ученым В.Роббинсом и немецким ученым В.Котте. Независимо друг от друга они показали возможность выращивания меристем кончи­ков корней томатов и кукурузы на синтетической питательной среде. Считается, что их работы легли в основу метода культуры изолированных корней растения.

Настоящее развитие метода культуры тканей и клеток высших растений началось в 1932 г. с работ французского ученого Р. Готре и американского исследователя Ф.Уайта. Они показали, что при периодической пересадке на свежую питательную среду кончики корней могут расти неограниченно долго. Кроме того, ими были разработаны методы культивирования новых объектов: тканей древесных растений камбиального происхождения, каллусных тканей запасающей паренхимы (Р. Готре), а также тканей расти­тельных опухолей (Ф.Уайт). С этого момента начинаются массо­вые исследования по разработке новых питательных сред, вклю­чающих даже такие неконтролируемые компоненты, как березо­вый сок или эндосперм кокоса, и по введению в культуру новых объектов. К 1959 г. насчитывалось уже 142 вида высших растений, выращиваемых в стерильной культуре.

В 1955 г. после открытия Ф. Скугом и С. Миллером нового клас­са фитогормонов — цитокининов — оказалось, что при совмест­ном их действии с другим классом фитогормонов — ауксинами — появилась возможность стимулировать деление клеток, поддер­живать рост каллусной ткани, индуцировать морфогенез в конт­ролируемых условиях.

В 1959 г. был предложен метод выращивания больших масс кле­точных суспензий. Важным событием стала разработка Е. Коккин-гом (Ноттингемский университет, Великобритания) в 1960 г. ме­тода получения изолированных протопластов. Это послужило тол­чком к получению соматических гибридов, введению в протопла­сты вирусных РНК, клеточных органелл, клеток прокариот. В это же время Дж. Морелом и Р. Г. Бутенко был предложен метод кло-нального микроразмножения, который сразу же нашел широкое практическое применение. Весьма важным достижением в разви­тии технологий культивирования изолированных тканей и клеток стало культивирование одиночной клетки с помощью ткани-«нянь­ки». Этот метод был разработан в России в 1969 г. в Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН под руководством Р. Г. Бутенко. В последние десятилетия продолжается быстрый про­гресс технологий клеточной инженерии, позволяющих значительно облегчить селекционную работу. Большие успехи достигнуты в раз­витии методов получения трансгенных растений, технологий ис­пользования изолированных тканей и клеток травянистых расте­ний, начато культивирование тканей древесных растений.

МЕТОДЫ И УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ И КЛЕТОК РАСТЕНИЙ

Выращивание изолированных клеток и тканей на искусствен­ных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) получи­ло название метода культуры изолированных тканей.

В связи с тем что в жизни человека наибольшее значение име­ют семенные растения, методы и условия для их культивирова­ния разработаны лучше, чем для голосеменных растений или во­дорослей, выращивание которых в стерильных условиях вызывает определенные затруднения. Однако независимо от принадлежнос­ти растений к той или иной таксономической группе существуют общие требования к выращиванию объектов в культуре in vitro.

Асептика. Прежде всего культивирование фрагментов ткани или органа растения — эксплантов, а тем более отдельных клеток тре­бует соблюдения полной асептики. Микроорганизмы, которые мо­гут попасть в питательную среду, выделяют токсины, ингибирую-щие рост клеток и приводящие культуру к гибели. Поэтому при всех манипуляциях с клетками и тканями при культивировании in vitro соблюдают определенные правила асептики в ламинар-боксе или в асептических комнатах. В первом случае асептика дос­тигается подачей профильтрованного стерильного воздуха, направ­ленного из ламинкар-бокса наружу, на работающего. Асептичес­кие комнаты стерилизуют с помощью ультрафиолетовых ламп, а работают в таких помещениях в стерильной одежде. Рабочую по­верхность столов в асептических комнатах и инструменты перед работой дополнительно стерилизуют спиртом.

Чистую посуду, предварительно завернутую в бумагу или в фоль­гу, инструменты, бумагу, вату стерилизуют сухим жаром в сушиль­ном шкафу при температуре 160 °С в течение 1,5 — 2 ч. Питательные среды стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С и повышен­ном давлении в течение 15 — 20 мин. Если в состав питательных сред входят вещества, разрушающиеся при автоклавировании, их сле­дует стерилизовать путем фильтрации через бактериальный фильтр. Затем стерильные профильтрованные компоненты добавляют в проавтоклавированную среду, охлажденную до температуры 40 °С.

Растительные ткани сами по себе могут служить серьезным источ­ником заражения, так как на их поверхности всегда находится эпи-фитная микрофлора. Поэтому необходима поверхностная стерили­зация, которую проводят следующим образом. Предварительно часть растения, из которой будет извлечен эксплант, промывают водой с мылом и споласкивают чистой водой. Затем растительный материал стерилизуют в растворах дезинфицирующих веществ. Некоторые из этих веществ, а также время стерилизации представлены в табл. 6.1.

После выдерживания эксплантов в дезинфицирующем раство­ре их несколько раз промывают в дистиллированной воде и скаль­пелем удаляют наружный слой клеток на срезах эксплантов, так как он может быть поврежден при стерилизации.

Микроорганизмы могут находиться и внутри растительной тка­ни. Наиболее часто внутреннее инфицирование встречается у тро­пических и субтропических растений. Поэтому кроме поверхност­ной стерилизации иногда приходится применять антибиотики, ко­торые и убивают микробную флору внутри ткани. Следует, одна­ко, заметить, что подобная обработка не всегда приводит к сте­рилизации внутренних тканей, так как трудно выбрать направ­ленно действующий антибиотик.

Питательные среды. Изолированные клетки и ткани культиви­руют на многокомпонентных питательных средах. Они могут су­щественно различаться по своему составу, однако, в состав всех сред обязательно входят необходимые растениям макро- и мик­роэлементы, углеводы, витамины, фитогормоны и их синтети­ческие аналоги. Углеводы (обычно это сахароза или глюкоза) вхо­дят в состав любой питательной смеси в концентрации 2 — 3%. Они необходимы в качестве питательного компонента, так как большинство каллусных тканей лишено хлорофилла и не способ­но к автотрофному питанию. Поэтому их выращивают в условиях рассеянного освещения или в темноте. Исключение составляет кал-лусная ткань мандрагоры, амаранта и некоторых других растений.

Обязательными компонентами питательных сред должны быть ауксины, вызывающие дедифференцировку клеток экспланта, и цитокинины, индуцирующие клеточные деления. При изменении со­отношения между этими фитогормонами или при добавлении дру­гих фитогормонов могут быть вызваны разные типы морфогенеза.

Высокое содержание нитратов, ионов аммония, калия, фос­фата способствует быстрому росту клеток. Истощение среды зна­чительно снижает рост и процессы вторичного метаболизма. Од­нако изначально низкое содержание фосфатов в питательной сре­де способно стимулировать синтез вторичных метаболитов. Уста­новлено, что культивирование каллусов солодки голой на среде с половинной концентрацией азота и фосфора в темноте увеличи­вает содержание фенольных соединений в 1,6 раза по сравнению с каллусами, растущими на полной среде. В среду могут быть до­бавлены эндоспермы незрелых зародышей (кокосовый орех, кон­ский каштан и др.), пасока некоторых деревьев, различные экст­ракты (солодовый, дрожжевой, томатный сок). Введение их в сре­ду дает интересные результаты, но такие эксперименты трудно воспроизводимы, так как действующий компонент, как правило, точно неизвестен. Например, добавление в питательную среду от­дельных фракций кокосового молока не давало никаких результа­тов, в то время как нефракционированный эндосперм вызывал деление клеток.

При приготовлении твердых питательных сред для поверхнос­тного выращивания каллусных тканей используют очищенный агар-агар — полисахарид, получаемый из морских водорослей. В качестве примеров в табл. 6.2 приведены составы наиболее рас­пространенных питательных сред.

Среда Мурасиге и Скуга — самая универсальная. Она пригодна для образования каллусов, поддержания неорганизованного каллусного роста, индукции морфогенеза у большинства двудольных растений. Так, изменение соотношения ауксина и кинетина при­водит к образованию либо корней (преобладание ауксина), либо стеблевых культур (преобладание кинетина).

Среда Гамборга и Эвелега хорошо подходит для культивирова­ния клеток и тканей бобовых растений и злаков, среда Уайта обес­печивает укоренение побегов и нормальный рост стебля после регенерации, а среда Нича и Нич пригодна для индукции андрогенеза в культуре пыльников.

Физические факторы. На рост и развитие растительных тканей in vitro большое влияние оказывают физические факторы — свет, температура, аэрация, влажность.

Свет. Большинство каллусных тканей могут расти в условиях слабого освещения или в темноте, так как они не способны фото-синтезировать. Вместе с тем свет может выступать как фактор, обеспечивающий морфогенез и активирующий процессы вторичного синтеза.

В качестве источника света используют люминесцент­ные лампы. Для большинства травянистых растений оптимум ос­вещенности составляет примерно 1000 люкс. Слишком низкая (300 люкс) или высокая (3000—10 000 люкс) освещенность подавляет рост. Освещение может влиять на метаболизм каллусных клеток. Так, в культурах чайного растения под действием света увеличивался биосинтез полифенолов. Напротив, в культуре клеток Scopolia parviflora свет подавлял образование алкалоидов. Кроме интенсивности освещенности на культуру ткани и ее физиологические особенно­сти влияет качество света. Так, более 20 флавонов и флавоноловых гликозидов образуется в культурах клеток петрушки после освеще­ния ее непрерывным люминесцентным светом «холодный белый». Вместе с тем синтез флавоновых гликозидов активируется при по­следовательном облучении ультрафиолетовым светом, а затем све­том, лежащим в области «красный—длинноволновый красный».

Температура. Для большинства каллусных культур оптимальна температура 26 °С. В то же время каллусы и культуры клеток диоскореи дельтовидной хорошо растут даже при температуре 32 °С. В отличие от роста культур клеток и тканей индукция их морфоге­неза требует более низких температур (18 — 20 °С). Влияние тем­пературы на метаболизм клеток in vitro изучено слабо. Есть дан­ные, что в каллусных культурах максимальное образование алка­лоидов наблюдалось при температуре 25 °С, а при повышении тем­пературы резко снижалось. В суспензионных культурах клеток Ipomoea содержание жирных кислот значительно увеличивалось, если их выращивали при субоптимальных температурах роста (15 °С). Поэтому при выращивании культуры in vitro необходимо тща­тельно изучать влияние всех абиотических факторов, в том числе температурного, на рост и метаболизм клеток.

Аэрация. Для выращивания суспензионных культур большое значение имеет аэрация. Особенно важно снабжение воздухом куль­тивируемых клеток в больших объемах ферментеров.

При сравнении разных типов ферментеров было показано, что синтез вторичных метаболитов в суспензионной культуре был наи­большим при подаче воздуха снизу. При выращивании клеток в малых объемах (в колбах) нормальная аэрация достигается при постоянном перемешивании суспензии.

Влажность. Оптимальная влажность в помещении, где растут культуры, должна составлять 60 — 70%.

Таким образом, культивирование клеток и тканей зависит от мно­гих факторов внешней среды, и действие их не всегда хорошо изве­стно. Поэтому при введении в культуру нового вида растений необ­ходимо прежде всего тщательно изучить влияние физических фак­торов на рост и физиологические характеристики этой культуры.

Источник

Что такое питательные среды для клеток и тканей

В настоящее время технология культивирования клеток млекопитающих стала одним из основных направлений, без которого невозможен научный прогресс в биологии, медицине и фармакологии. Изучение культур клеток животных и человека позволяют исследовать механизмы клеточного взаимодействия, дифференцировки и дедифференцировки клеток, трансдукцию сигналов, а также реакцию клеток на внешнее воздействие и многое другое. Кроме того, клеточные и тканевые культуры используют в качестве модельных систем для изучения механизмов патогенеза при различных заболеваниях, для оценки эффективности и токсичности новых лекарственных средств, они применяются для производства вакцин и биофармацевтических препаратов, задействованы во вспомогательных репродуктивных технологиях. С каждым годом во всем мире растет популярность нового направления, регенеративной медицины, основанной на технологии культивирования клеток человека [1]. Независимо от назначения клеточной культуры, для поддержания стабильного роста и размножения клеток ключевым фактором является выбор соответствующей питательной среды, способной обеспечить клетки элементами питания, метаболитами, необходимыми для биосинтеза, регуляторными факторами, веществами, способными выполнять защитные функции. Кроме того, культуральная среда непосредственно влияет на результаты исследований, скорость производства биофармацевтических препаратов или соответствие полученной культуры медицинским требованиям. Таким образом, целью данной статьи является обзор наиболее часто применяемых питательных сред, их классификации, состава и необходимости внесения дополнительных компонентов для создания оптимальных условий при культивировании клеток млекопитающих.

Классификация питательных сред

Со момента появления первых сообщений, посвященных культивированию клеток, тканей или органов вне живого организма, исследователей занимал вопрос о составе питательной среды, достаточном для поддержания жизнеспособности клеток и возможности их пролиферации [1–3]. И несмотря на огромный выбор коммерческих сред и добавок для выращивания клеток в искусственных условиях, проблема выбора питательной среды до сих пор не утратила актуальности [4–6].

Классически питательные среды, используемые для культивирования клеток животных, подразделяют на естественные (или природные) и искусственные (или синтетические). К естественным питательным средам относятся биологические жидкости (плазма, сыворотка, лимфа, сыворотка пуповинной крови человека, амниотическая жидкость), тканевые экстракты (экстракт печени, селезенки, костный мозг, экстракты бычьего и куриного эмбрионов), коагуляты или сгустки плазмы крови. Искусственные среды подразделяются на сбалансированные солевые растворы, образующие основу для комплексных сред (фосфатно-солевой буфер – PBS, фосфатный буфер Дульбекко – DPBS, раствор Хэнкса – HBSS, раствор Эрла – EBSS), основные или минимальные среды (MEM, DMEM) и комплексные среды (RPMI-1640, IMDM, F-10 и F-12 Хэма) [1, 6].

Естественные среды очень удобны, эффективны и подходят для культивирования широкого спектра культур клеток животных. Однако основными недостатками таких сред являются низкая воспроизводимость из-за варьирования компонентов в разных партиях и отсутствие информации об их точном составе. Искусственные или синтетические среды получают путем объединения питательных веществ (как органических, так и неорганических), витаминов, солей, сывороточных белков, углеводов, кофакторов. В настоящее время разработаны различные искусственные среды, обеспечивающие выполнение одной или нескольких задач, таких как поддержание жизнеспособности, длительное культивирование, неограниченный рост культуры или специализированные функции. Клетки животных можно культивировать, используя исключительно естественную питательную среду или искусственную среду с добавлением натуральных компонентов [1, 6].

В зависимости от состава искусственные среды также классифицируют на среды, содержащие сыворотку, бессывороточные среды, безбелковые среды и химически определенные среды.

Бессывороточные среды (serum-free media) были разработаны для устранения недостатков, связанных с влиянием сыворотки на конечный результат эксперимента, например при интерпретации в иммунологических исследованиях [7]. Как правило, они предназначены для культур, состоящих из клеток одного типа (например, Knockout Serum Replacement и Knockout DMEM от Thermo Fisher Scientific для стволовых клеток) и включают определенные количества очищенных факторов роста, протеинов и липопротеинов, источником которых традиционно является сыворотка [8]. Такие среды относятся к «определенным культуральным средам», так как их компоненты известны. В случае, когда бессывороточные среды дополняют фракциями общего белка (бычьего сывороточного альбумина, α- или β-глобулина), они относятся к «химически неопределенным средам» [1, 5].

Безбелковые среды (protein-free media) не содержат высокомолекулярные протеины, но могут включать пептидные фракции (гидролизаты белков) [1]. По сравнению со средами, дополненными сывороткой, применение безбелковых сред способствует активному росту клеток и экспрессии белка, а также облегчает последующую очистку любого экспрессированного продукта, например моноклональных антител [5, 9]. Примерами безбелковых сред могут служить MEM и RPMI-1640, которые при необходимости могут быть дополнены белковыми компонентами.

В состав химически определенных сред (chemically defined media) не входят белковые фракции, гидролизаты или экстракты тканей, такие среды включает только химически чистые, не содержащие примеси неорганические и органические компоненты. В их состав могут входить белковые добавки, такие как факторы роста, продуцируемые в бактериях или дрожжах генноинженерным способом с последующим добавлением витаминов, холестерина, специфических аминокислот и жирных кислот [1, 5, 6].

Некоторые авторы также выделяют среды, не содержащие чужеродных компонентов (xeno-free media или animal-derived component-free media), в состав которых входят только соединения человеческого, но не животного происхождения (например, сывороточный альбумин человека) [10]. При этом среды, не содержащие компоненты животного происхождения, могут включать бактериальные, дрожжевые гидролизаты или растительные экстракты [1, 5].

Компоненты питательной среды

Выбор питательной среды непосредственно влияет на возможность длительного поддержания клеток в культуре, способность клеток активно пролиферировать, экспрессировать целевой продукт или выполнять какую-либо функцию. В связи с этим при планировании эксперимента, а также при подборе питательной среды и условий культивирования необходимо учитывать особенности и функции компонентов, составляющих ее основу, чем и определяется неослабевающий интерес исследователей к потребностям клеток в питательных элементах и к возможности их восполнения культуральной средой [11–13].

Состав питательных сред варьирует в зависимости от типа клеток, для культивирования которых среда была разработана, от функционального назначения среды и от представлений ее составителя о потребностях клеток, выращиваемых в искусственных условиях. Однако обязательные компоненты, обеспечивающие жизнеспособность клеток вне живого организма, присутствуют со всех составах коммерческих сред.

Буферная система. Поддержание оптимального уровня рН является обязательным условием культивирования клеток in vitro. Наиболее распространенными являются два типа буферных систем – на основе бикарбоната натрия и на основе HEPES.

Бикарбонатная буферная система обеспечивает постоянный уровень рН равновесным соотношением между бикарбонатом натрия (NaHCO3) в культуральной среде и CO2 в инкубаторе, при этом она является недорогой и нетоксичной для клеток. В результате повышения концентрации CO2 в газовой фазе увеличивается количество CO2, растворенного в питательной среде, что ведет к росту концентрации H2CO3 и понижению рН. Напротив, если концентрация CO2 газовой фазы снижена, то рН повышается за счет обратной реакции [4, 14]. Как правило, теоретически оптимальной концентрацией СО2 в инкубаторе считается 5–6 %, однако фактически она должна регулироваться в зависимости от концентрации NaHCO3 в культуральной среде. Например, уровень СО2 5 % адекватен при содержании в среде 26 ммоль/л NaHCO3 (среда MEM), 2 % CO2 соответствует 14 ммоль/л NaHCO3 (среда F-12 Хэма), 10 % CO2 – 44 ммоль/л NaHCO3 (среда DMEM) [11]. Эти величины являются теоретическими значениями, вычисленными при помощи уравнения Хендерсона – Хассельбаха

(pH = pKa + log[HCO3−]/[CO2](жидкой фазы),

где pKa – отрицательный логарифм константы кислотной диссоциации), на практике рекомендуется проверять pH питательной среды после достижения равновесия, а затем корректировать концентрацию CO2 [1, 15].

HEPES или (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота) обладает большей буферной емкостью, чем бикарбонатная система, и обеспечивает стабильный уровень рН среды в диапазоне рН 7,2–7,4 даже в условиях культивирования клеток вне CO2 инкубатора. Применение HEPES также целесообразно при поддержании культур с высокой плотностью клеток, когда рН быстро снижается вследствие накопления метаболитов, например лактата, и в случае использования бессывороточных сред, лишенных буферного воздействия сыворотки [6, 14]. В то же время буферная система на основе HEPES является более дорогостоящей и может оказывать негативное влияние на определенные типы клеток, такие как эпифизарные хондроциты куриных эмбрионов и эмбриональные стволовые клетки [16]. Также было показано, что HEPES повышает чувствительность среды к фототоксическим эффектам, индуцированным воздействием флуоресцентного света, усиливая генерацию цитотоксичных продуктов, в основном перекиси водорода [17]. Поэтому при использовании буферной системы, основанной на HEPES, следует тестировать воздействие буфера на культивируемые клетки.

Феноловый красный. Большинство предлагаемых коммерческих сред содержат феноловый красный в качестве индикатора рН, что позволяет непрерывно отслеживать уровень кислотности культуральной среды. При низком уровне рН феноловый красный становится желтым, тогда как при высоких уровнях рН он имеет пурпурную окраску, ярко-красный цвет среды соответствует рН 7,4, оптимальному для культивирования клеток животных [1, 11]. Однако добавление индикатора в среды имеет ряд недостатков: 1. Феноловый красный имитирует действие стероидных гормонов, например эстрогена, что оказывает влияние на пролиферацию некоторых клеток млекопитающих [18]. 2. Присутствие фенолового красного в ряде бессывороточных композиций нарушает калий-натриевый гомеостаз, однако этот эффект можно нейтрализовать, включив в состав среды сывороточный или бычий гормон гипофиза. 3. Феноловый красный может искажать результаты в исследованиях, основанных на проточной цитометрии. Поэтому при его добавлении в среду следует проверять, оказывает ли он какое-либо воздействие на культивируемые клетки и на эмпирические результаты, особенно при работе с чувствительными к эстрогену клетками, такими как клетки молочной железы [6, 18].

Неорганические соли в средах способствуют поддержанию осмотического баланса и помогают регулировать мембранный потенциал [6]. Основными ионами, входящими в состав культуральных сред являются Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl−, SO42–, PO43− и HCO3 [12]. Кальций (

10−3 M) обеспечивает адгезию клеток к субстрату, и в средах, предназначенных для суспензионных культур, его концентрация снижена. Кроме того, он играет роль в сигнальной трансдукции, и концентрация этого иона является определяющей для размножения или дифференцировки клеток. Магний (

10–4 M) является ключевым ионом для поддержания активности ряда ферментов, он также влияет на стабильность мембраны. Натрий (

10–1 M) ответственны за мембранный потенциал клеток, тогда как анионы фосфата (

10–6 M) и гидрокарбоната (

10–2 М) необходимы для синтеза внеклеточного матрикса и играют роль в регуляции внутриклеточного заряда [4, 14].

Углеводы в форме сахаров являются основным источником энергии для культивируемых клеток. Наиболее распространенным элементом питания в коммерческих средах является глюкоза [11], однако некоторые могут содержать галактозу, мальтозу или фруктозу [4, 6]. В зависимости от метаболической активности клеток и скорости их пролиферации для поддержания культур некоторых типов клеток требуется большее количество питательных веществ. Такие особенности культуры следует учитывать при выборе среды. Например, среда DMEM изначально содержала 5,6 ммоль/л глюкозы, но сейчас для клеток с активным метаболизмом доступен модифицированный вариант с повышенной концентрацией глюкозы, 25 ммоль/л. Однако применение этой среды для культивирования активно пролиферирующих клеток может приводить к быстрому накоплению в среде таких метаболитов, как лактат (в искусственной среде клетки получают энергию преимущественно за счет гликолиза), что вызывает снижение рН раствора [11]. В данном случае рекомендуется более частая замена среды или использование буферной системы HEPES, обладающей большей буферной емкостью [1].

Аминокислоты входят в состав белков, что определяет их обязательное присутствие во всех средах; они необходимы для пролиферации клеток, поэтому их концентрация определяет максимальную плотность, которую культура может достичь [13, 14]. Так как клетки неспособны синтезировать незаменимые аминокислоты, они должны быть включены в состав питательной среды, в отличие от заменимых аминокислот, которые, как правило, не входят в состав основных сред (BME и MEM). Однако не все типы клеток способны синтезировать достаточное количество заменимых аминокислот в искусственных условиях. Поэтому внесение их в питательную среду (например, среда F-12 Хэма) может обеспечить благоприятные условия для роста и размножения клеток, а также позволяет снизить биосинтетическую нагрузку на клетки, способные синтезировать аминокислоты с необходимой для поддержания жизнедеятельности скоростью. Особое внимание следует уделять аминокислотам с разветвленной цепью, валину, лейцину и изолейцину. Все они относятся к группе незаменимых аминокислот, и для культивирования некоторых типов клеток, включая человеческие фибробласты и клетки мышиной миеломы, необходима высокая их концентрация. Для данных культур рекомендуется своевременная замена среды или дополнительное внесение аминокислот в процессе культивирования [1].

Особенно важна для культивируемых клеток такая аминокислота, как L-глутамин. Он обеспечивает клетки азотом, необходимым для НАД, НАДФН, биосинтеза нуклеотидов и белков, а также служит дополнительным источником энергии для метаболизма (участвуя в цикле лимонной кислоты) [11, 13]. Потребность клеток в этой аминокислоте в 3–40 раз (в зависимости от типа клеток) превышает потребность в других аминокислотах; добавление глутамина необходимо при культивировании клеток, требовательных к повышенному содержанию питательных компонентов в среде [2]. Однако стоит учитывать, что глутамин стабилен приблизительно в течение 3 недель при 4ºС [19] и легко разлагается в среде с образованием аммиака, оказывающего токсическое воздействие на клетки [11, 20, 21], поэтому предпочтительным является добавление глутамина к среде непосредственно пред употреблением или использованием его производных, более устойчивых к деградации, таких как L-аланил-L-глутамин или глицил-L-глутамин [1, 4]. Эти дипептиды, известные также под коммерческим названием GLUTAMAX™, более термостабильны, чем глутамин, и могут выдерживать стерилизацию автоклавированием [22]. В клетках они расщепляются пептидазами, высвобождая глутамин и аланин или глицин, поэтому доступность глутамина зависит от пептидазной активности клеток, что определяет его невысокую внутриклеточную концентрацию и снижает риск образования токсичных количеств аммиака [5]. Таким образом, дипептиды могут заменять глутамин при длительном культивировании медленно растущих клеточных культур.

Витамины необходимы в качестве предшественников различных кофакторов для пролиферации и роста клеток. Витамины группы B наиболее часто вносят в культуральные среды для стимулирования роста [6], витамины С и Е обладают антиоксидантными свойствами [1]. По большей части водорастворимые витамины (B1, B2, B6, B12, C, фолиевая кислота) присутствуют в основных средах [12]; что касается жирорастворимых витаминов (A, D, E, K), то их состав и количество часто ограничены, в достаточных концентрациях они присутствуют только в сложных средах, таких как среда 199, RPMI 1640 [4, 14]. Основным недостатком добавления витаминов в питательные среды является их нестабильность: витамины A, C, D и E быстро деградируют при окислении кислородом воздуха, кроме того, витамин С окисляется в результате реакции с микроэлементами, что может сопровождаться генерацией активных форм кислорода. На скорость распада витаминов A, B1, B2, B12, C и K также влияет свет, деградации витаминов B1 и B5 способствует повышение температуры. Фолаты отличаются слабой растворимостью и в некоторых случаях могут быть частично удалены из среды во время стерилизации фильтрацией. Гидроксокобаламин и аскорбиновая кислота взаимодействуют, способствуя взаимной деградации [1].

Сыворотка животных представляет собой сложный комплекс высокомолекулярных и низкомолекулярных биомолекул с различными, физиологически сбалансированными стимулирующими и ингибирующими рост активностями [23]. Широкое распространение в технологии культивирования клеток получили сыворотки взрослых (лошадиная сыворотка), новорожденных животных (телячья сыворотка) или эмбриональные сыворотки (эмбриональная или фетальная бычья сыворотка – FBS). Последняя на сегодняшний день является наиболее популярной и повсеместно используемой сывороткой. Эмбриональная бычья сыворотка богата факторами роста и содержит низкий уровень γ-глобулинов (которые обладают ингибирующей рост клеток активностью), поэтому она подходит как для клонирования клеток, так и для поддержания пролиферации клеток, выращивание которых в искусственных условиях вызывает трудности. Телячья сыворотка, напротив, обладает слабой стимулирующей рост активностью, поэтому используется в основном для изучения контактного ингибирования или при исследовании клеточной дифференциации, когда факторы роста могут искажать результат [4, 7]. Еще она причина, по которой сыворотка теленка может оказаться предпочтительнее эмбриональной сыворотки, это содержание липидов, которое повышается в сыворотке после рождения с течением времени, поэтому при культивировании клеток, требующих высокого содержания липидов, выбирают телячью сыворотку или сыворотку взрослого быка [1]. Лошадиная сыворотка, получаемая от взрослых лошадей, характеризуется сравнительно высокой однородностью разных партий. Она отличается низкой концентрацией полиаминоксидазы [24], участвующей в синтезе полиаминов, которые стимулируют пролиферацию клеток и медленно метаболизируются [1, 25].

Состав сыворотки животного происхождения очень сложен, многообразен и может варьировать в зависимости от лота, партии или фирмы – производителя продукта. К компонентам, идентифицированным в сыворотке, относятся следующие биомолекулы [1, 6, 23]:

− белки, среди которых выделяют сывороточные белки (альбумин, глобулины, в том числе иммуноглобулины), транспортные белки (трансферрин, транскортин, липопротеины α1 и β1), ингибиторы протеаз (α1-антитрипсин и α2-макроглобулин), факторы прикрепления (фибронектин, ламинин) и факторы распространения, а также ферменты (лактатдегидрогеназа, щелочная фосфатаза, γ-глутамилтрансфераза и др.);

− небелковые соединения, содержащие азот (пурины и пиримидины, аминокислоты, полиамины, креатинин, мочевина);

− углеводы (глюкоза, галактоза, фруктоза, манноза, рибоза);

− гормоны (инсулин, глюкагон, соматотропин, кортикостероиды, тиреоидные и паратиреоидные гормоны, андрогены, эстроген, прогестерон, пролактин, фолликулостимулирующий гормон, вазопрессин, простагландины и др.);

− факторы роста и цитокины (эпидермальный фактор роста – EGF, фактор роста фибробластов – FGF, инсулиноподобный фактор роста – IGF, фатор роста нервной ткани – NGF, фактор роста тромбоцитов – PDGF, трансформирующий фатор роста – TGF, фактор роста эндотелиальных клеток – ECGF, интерлейкины, интерфероны);

− липиды и жирные кислоты, свободные или связанные с белками (холестерин, стероиды, этаноламин, холин, инозитол, фосфолипиды, триглицериды; пальмитат, стеарат, олеат, линолеат и другие);

− витамины (водорастворимые – B1, B2, B6, B12, C, фолиевая кислота, биотин, никотиновая кислота, пантотеновая кислота; жирорастворимые – A, D, E, K);

− микроэлементы (Fe, Zn, Cu, Cr, I, Co, Se, Mn, Mo и др.).

Многокомпонентный состав сыворотки определяет множественность выполняемых ею функций: она обеспечивает клетки элементами питания, стимулирует их рост и пролиферацию, способствует прикреплению к субстрату и распространению по всему объему культурального сосуда; повышая вязкость среды, сыворотка защищает культуру от механических повреждений при перемещении или пипетировании, протеазы обеспечивают защиту клеток от лизиса; кроме того, сыворотка увеличивает буферную емкость среды. Как правило, в питательные среды вносят от 2 % до 15 % сыворотки [6, 7, 9].

Однако, несмотря на значение сыворотки для поддержания жизнеспособности клеток в искусственных условиях, ее применение имеет ряд недостатков [23, 25, 26], таких как низкая воспроизводимость результатов вследствие варьирования состава разных лотов, возможность присутствия в сыворотке факторов, ингибирующих рост клеток, увеличение риска контаминации (например, вирусами). Также добавление сыворотки может влиять на производимый клетками продукт и препятствовать его дальнейшей очистке [9]. В случаях, когда применение сыворотки является нежелательным, исследователи могут использовать так называемые заменители сыворотки [8, 27]. Они включают экстракты сыворотки, экстракты тканей или гидролизаты [10], в том числе лизаты тромбоцитов факторы роста [28, 29], гормоны, белки-переносчики (альбумин и трансферрин), липиды, металлы, витамины, полиамины и восстановители (2-меркапоэтанол, α-тиоглицерин, восстановленный глутатион) [30, 31]. Количество комбинаций этих соединений практически бесконечно, при этом они, как правило, взаимодействуют друг с другом. Их подбор требует огромных усилий, времени и затрат, так как невозможно составить оптимальную среду, добавляя вещества случайным образом и в произвольных комбинациях. Коммерческие бессывороточные и безбелковые среды показывают хорошие результаты при культивировании клеток [32], однако их состав почти никогда не раскрывается и их нельзя отнести к «химически определенным».

Антибиотики в процессе культивирования клеток млекопитающих используются для сдерживания роста бактериальных и грибковых контаминантов, особенно в процессе получения первичных культур [33]. Наиболее распространенными антибиотиками являются: пенициллин (100 ед/мл; ингибирование синтеза клеточной стенки бактерий), стрептомицин (100 мкг/мл; влияние на синтез белка), гентамицин (50 мкг/мл; ингибирование синтеза белка) [4, 19]. Из антимикотиков чаще применяют амфотерицин В (2,5 мкг/мл; нарушение барьерной функции мембраны). Однако регулярное применение антибиотиков может привести к развитию резистентности у бактерий, а также препятствует обнаружению в культуре контаминантных микоплазм [19]. Кроме того, антибиотики могут влиять на метаболизм чувствительных клеток. В связи с этим общей рекомендацией является строгое соблюдение правил асептики и отказ от регулярного использования антибиотиков в рутинных процедурах культивирования клеток [4, 6, 14].

Выбор культуральной среды

Каждый вид питательной среды был разработан для определенного типа клеток, в соответствии с их происхождением (видом животного) и целью культивирования. Среды MEM, DMEM или F-12 Хэма, как правило, применяют для поддержания адгезионных клеточных культур, среду RPMI 1640 – для суспензионных культур. Еще одним значимым вопросом при выборе среды является вопрос о добавлении природных компонентов. Например, MEM (предложенная Иглом) была разработана с учетом добавления сыворотки и потому содержит только минимально необходимые компоненты (неорганические соли, сахар, незаменимые аминокислоты и водорастворимые витамины), тогда как среда 199 и среда Хэма F-12, предназначенные для культивирования клеток без сыворотки, имеют более сложный состав. Ниже приведены типы клеток и клеточных линий, для культивирования которых можно использовать наиболее распространенные питательные среды [1, 6]:

MEM (минимальная питательная среда Игла) содержит сбалансированный солевой раствор, заменимые аминокислоты и пируват натрия, подходит для культивирования эмбриональных фибробластов цыплят, клеток яичника китайского хомячка, эмбриональных нервных клеток, альвеолярных клеток, эндотелиальных, эпидермальных клеток, фибробластов, глиальных клеток, клеток глиомы, меланомы, опухолевых клеток человека;

DMEM (модифицированная Дульбекко среда Игла) отличается от EMEM более высокой концентрацией аминокислот (примерно в 2 раза) и витаминов (в 4 раза), а также содержит нитрат железа, пируват натрия и несколько дополнительных аминокислот. Данную среду первоначально использовали для культур эмбриональных стволовых клеток мыши, однако впоследствии ее применяли для широкого спектра животных клеток и клеточных линий: для эндотелиальных клеток, эмбриональных альвеолярных клеток, клеток цервикального эпителия, клеток желудочно-кишечного тракта, клеток щитовидной железы свиньи, клеток скелетных мышц, клеток Сертоли, фибробластов сирийского хомяка, клеток мышиной нейробластомы, клеточных линий на основе клеток, полученных от пациентов с раком яичников;

RPMI-1640 (среда, разработанная в Мемориальном институте Розуэлл Парка для лимфоцитов периферической крови) используется для культивирования Т-клеток и тимоцитов, стволовых гемопоэтических клеток, клеток печени крыс, мышиных гибридом, опухолевых клеток человека, линий клеток миелоидной лейкемии и лимфобластного лейкоза человека, клеток миеломы мыши, клеток лейкемии и эритролейкемии мыши.

Комплексные среды F-10 и F-12 Хэма первоначально были созданы для поддержания клонального роста клеток яичника китайского хомяка (CHO), при этом среда Хэма F-12, дополненная 25 мМ HEPES, обладает улучшенными буферными свойствами. Данные среды могут применяться для выращивания клеток пигментированной сетчатки куриного эмбриона, клеток костной, хрящевой и жировой тканей, эмбриональных клеток легких, клеток скелетных мышц.

IMDM (среда Дульбекко, модифицированная Исквым) является исключительно обогащенной синтетической средой, подходящей для быстро пролиферирующих культур клеток с высокой плотностью. Среда представляет собой модификацию DMEM, содержащую селен, дополнительные аминокислоты, витамины и неорганические соли, а также HEPES и пируват натрия. Среда была разработана для культивирования лимфоцитов и гибридом и может использоваться при культивировании клеток костного мозга, стволовых гематопоэтических клеток, линий клеток лимфобластного лейкоза человека.

Заключение

Выбор питательной среды определяет успех культивирования клеток, выбранных в качестве объекта исследования или модельной системы, возможность поддержания жизнеспособной культуры длительное время и способность клеток активно пролиферировать в искусственных условиях. В настоящее время коммерческое разно- образие доступных сред, готовых к употреблению или нуждающихся в незначительных дополнениях, а также сывороток, факторов роста, гормонов и других активных соединений достаточно велико и, при условии правильного выбора или эмпирического подбора наиболее целесообразных компонентов, позволяет обеспечивать стабильное поддержание множества типов клеток или клеточных линий в культуре.

Источник