Что такое полимеразная цепная реакция
Что такое полимеразная цепная реакция и как она работает?
ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) составляет основу бесчисленных исследований с участием живых организмов. Из кода ДНК мы можем определить генетическую основу заболеваний, разработать лекарства, провести судебно-медицинскую экспертизу, идентифицировать микробы и многое другое.
Самое главное, что нужно для такого исследования, — это большое количество исследуемого фрагмента ДНК. Однако ДНК, выделенной из клеток, тканей или любого другого биологического источника, часто бывает недостаточно для анализа. Таким образом, ученым нужно делать больше копий ДНК.
Именно здесь и проявляется решающая роль «полимеразной цепной реакции».
Что такое полимеразная цепная реакция?
ПЦР использует способность ферментов полимеразы создавать копии генетического материала в лабораторных условиях.
До появления ПЦР копии ДНК создавались путем выделения определенного фрагмента ДНК и вставки его в геном живых клеток. Живые клетки реплицировали вставленную ДНК, одновременно реплицируя свою собственную ДНК. Этот метод был трудоемким и длительным способом получения копий ДНК, достаточных для дальнейшего изучения.
Однако теперь это уже не так. Основная заслуга в этом принадлежит Кэри Маллису, который в 1983 году изобрел «полимеразную цепную реакцию» (ПЦР), положив начало «биотехнологической революции». Сегодня ПЦР является очень распространенной лабораторной техникой даже в небольших лабораториях и используется для создания копий ДНК на регулярной основе.
ПЦР может избирательно создавать копии интересующей ДНК посредством процесса, часто называемого «молекулярным фотокопированием». После синтеза нескольких копий ДНК с помощью ПЦР ДНК подвергается «амплификации».
Каковы компоненты реакции ПЦР?
Ключевыми компонентами реакции ПЦР являются матричная ДНК, праймеры, нуклеотиды и термостойкая ДНК-полимераза. Давайте кратко узнаем о каждом из этих компонентов.
Для ПЦР можно использовать ДНК от простейших бактерий до самых сложных животных и растений. Однако вся ДНК (шаблонная ДНК) не проходит ПЦР; в ходе процесса будет амплифицирована только небольшая часть.
Нуклеотиды, используемые для реакции ПЦР, представляют собой смесь всех четырех азотистых оснований, обнаруженных в ДНК. Это аденин (A), тимин (T), гуанин (G) и цитозин (C).
ДНК-полимераза, используемая в ПЦР, представляет собой термостабильную ДНК-полимеразу (часто называемую полимеразой Taq), выделенную из термофильных организмов, способных выдерживать высокие температуры.
Каковы этапы реакции ПЦР?
Активность полимеразы зависит от наличия одноцепочечной ДНК, с которой могут связываться праймеры. Этого можно добиться, нагрев образец ДНК при температуре 94-98 °C.
На следующем этапе праймеры связываются (отжигаются) с шаблонной ДНК в определенных местах. Прямой праймер связывается с началом шаблонной ДНК (одна нить двухцепочечной ДНК) на 3 п.н. нуклеотидной последовательности ATG (стартовый кодон). Обратный праймер связывается с концом комплементарной ДНК (второй нити двухцепочечной ДНК) на 3 п.н. нуклеотидных последовательностей TAG, TAA или TGA (стоп-кодоны). ДНК между стартовым и стоп-кодонами амплифицируется.
Успех этого этапа зависит от последовательности праймеров и температуры, выбранной для отжига, обычно 50-65 °C.
Последним и завершающим этапом является элонгация или терминация, которая происходит при 72 °C, оптимальной температуре для активности Taq-полимеразы. ДНК-полимераза распознает связанный с праймером участок ДНК и добавляет нуклеотиды, комплементарные нити шаблонной ДНК. Это происходит до тех пор, пока она не встретит второй праймер.
После успешной реакции терминации вместо одной спирали ДНК, использовавшейся на начальном этапе, образуются две спирали ДНК. В каждой из двух спиралей ДНК одна нить будет исходной нитью, полученной из образца ДНК. Другая нить будет комплементарной нитью, синтезированной ДНК-полимеразой в ходе ПЦР.
В чем заключается принцип амплификации ДНК с помощью ПЦР?
Этапы денатурации, отжига и полимеризации составляют один цикл ПЦР. Типичная реакция ПЦР может потребовать 25-35 циклов для оптимальной амплификации ДНК.
В конце одного цикла из одного шаблона ДНК образуются две молекулы ДНК. В конце двух циклов две ДНК образуют четыре молекулы ДНК, которые затем амплифицируются до восьми молекул ДНК в конце трех циклов. В конце n циклов будет 2n копий исходного шаблона ДНК.
После каждого цикла количество молекул ДНК, которые могут служить шаблонами для следующего цикла, увеличивается экспоненциально. Это увеличение числа шаблонов цикл за циклом является основой амплификации молекул ДНК в ПЦР.
Экспоненциальная амплификация молекул ДНК с помощью метода ПЦР
Каковы плюсы и минусы ПЦР?
Основные плюсы метода ПЦР заключаются в том, что он способен создавать миллионы и миллиарды копий ДНК всего за несколько часов. Этот метод быстр, относительно прост в освоении и может быть выполнен в базовых лабораторных условиях.
Основным недостатком является высокая чувствительность метода, поэтому образец, используемый для амплификации, должен быть свободен от загрязнений. Даже небольшие следы нежелательной ДНК могут амплифицироваться вместе с интересующей ДНК, что дает ложные результаты.
Другим недостатком является требование информации о последовательности ДНК для разработки праймеров. Кроме того, праймеры могут иногда отжигать не на тех участках ДНК. Такой неспецифический отжиг праймеров может привести к амплификации неправильного фрагмента ДНК.
В редких случаях ДНК-полимераза может включить неправильное основание, что приведет к изменению последовательности интересующей ДНК, что может повлиять на последующий процесс.
Для успешного проведения реакции ПЦР необходимо иметь чистый генетический материал, соответствующий набор праймеров и подходящую температуру отжига.
Где можно использовать эту технологию?
Он составляет основу большинства приложений, связанных с молекулярной биологией, клонированием генов, технологией рекомбинантной ДНК и мутагенезом.
Практическое развитие простой и универсальной техники ПЦР, предложенной Кэри Маллис, радикально изменило биологические исследования. Все, что нам нужно сделать, это смешать все компоненты ПЦР в соответствующих концентрациях в маленькой пробирке, загрузить ее в ПЦР-машину (термоциклер) и подождать несколько часов. После периода ожидания исследователи получат от миллионов до миллиарда копий интересующей вас ДНК. Разве это не удивительно?
Вот почему ПЦР всегда будет быстрым и надежным методом создания копий ДНК по сравнению с методами, использовавшимися до этого революционного открытия.
Анализ ПЦР — самый точный анализ на инфекции
» data-image-caption=»» data-medium-file=»https://i2.wp.com/medcentr-diana-spb.ru/wp-content/uploads/2017/01/Analiz-PTSR-v-klinike-DIANA.jpg?fit=450%2C265&ssl=1″ data-large-file=»https://i2.wp.com/medcentr-diana-spb.ru/wp-content/uploads/2017/01/Analiz-PTSR-v-klinike-DIANA.jpg?fit=900%2C530&ssl=1″ />
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это современный инструмент диагностики разнообразных инфекций, отличающийся высокой точностью. Анализ ПЦР позволяет определять возбудителей инфекционных заболеваний, опираясь на их генетический материал (РНК или ДНК). Биологическим материалом для исследования может служить кровь, мазок из половых органов, слюна и прочее.
Метод ПЦР был открыт в 1983. Его создатель Кэри Мюллис (США), за это открытие получил Нобелевскую премию в области химии. Уже за первые десять лет методика стала обязательным лабораторным исследованием во всем мире, получив признание ученых и врачей.
Анализ ПЦР в клинике ДИАНА
» data-image-caption=»» data-medium-file=»https://i2.wp.com/medcentr-diana-spb.ru/wp-content/uploads/2017/01/Analiz-PTSR-v-klinike-DIANA.jpg?fit=450%2C265&ssl=1″ data-large-file=»https://i2.wp.com/medcentr-diana-spb.ru/wp-content/uploads/2017/01/Analiz-PTSR-v-klinike-DIANA.jpg?fit=900%2C530&ssl=1″ loading=»lazy» src=»https://i1.wp.com/medcentr-diana-spb.ru/wp-content/uploads/2017/01/Analiz-PTSR-v-klinike-DIANA-900×530.jpg?resize=790%2C465″ alt=»Анализ ПЦР в клинике ДИАНА» width=»790″ height=»465″ srcset=»https://i2.wp.com/medcentr-diana-spb.ru/wp-content/uploads/2017/01/Analiz-PTSR-v-klinike-DIANA.jpg?resize=900%2C530&ssl=1 900w, https://i2.wp.com/medcentr-diana-spb.ru/wp-content/uploads/2017/01/Analiz-PTSR-v-klinike-DIANA.jpg?resize=450%2C265&ssl=1 450w, https://i2.wp.com/medcentr-diana-spb.ru/wp-content/uploads/2017/01/Analiz-PTSR-v-klinike-DIANA.jpg?resize=768%2C453&ssl=1 768w, https://i2.wp.com/medcentr-diana-spb.ru/wp-content/uploads/2017/01/Analiz-PTSR-v-klinike-DIANA.jpg?w=1018&ssl=1 1018w» sizes=»(max-width: 790px) 100vw, 790px» data-recalc-dims=»1″ />
Медицинский центр Диана предлагает провести исследование по методике полимеразной цепной реакции в кратчайшие сроки и с высочайшим уровнем точности. Наша диагностическая база соответствует всем международным стандартам и требованиям.
Какие инфекции можно диагностировать методом ПЦР
На диагностику отправляют гинеколог, уролог или дерматолог. Анализ ПЦР дает возможность диагностировать большое число разнообразных инфекций. В эту группу попадают и скрытые, бессимптомные заболевания, находящиеся в инкубационном периоде:
С помощью метода ПЦР можно обнаружить:
При каждом из вышеперечисленных заболеваний, обнаруженным другим методом, желательно делать и ПЦР — исследование. Возбудители многих инфекций имеют несколько типов (штаммов), а более точная диагностика делает лечение эффективнее. Поскольку разные типы возбудителей обладают своими способами передачи инфекции, точное определение возбудителя помогает уберечь от заражения окружающих. Например, гепатитом А можно заразиться через общие предметы и посуду (болезнь грязных рук), а гепатитом С — только через кровь, медицинские инструменты и половые контакты. Это важно для тех, кто находится рядом с больным.
Суть метода полимеразной цепной реакции
Метод основан на выявлении возбудителя по участкам ДНК или РНК. ПЦР напоминает криминалистику, когда преступника находят по частичкам кожи или волосам, оставленным на месте преступления. Поскольку каждый живой организм имеет уникальную структуру ДНК или РНК. Метод позволяет безошибочно идентифицировать микроорганизм, даже если он присутствует в исследуемом материале в минимальных количествах.
ПРЦ подходит для выявления скрытого носительства, нетипичных, стертых и прочих форм заразных заболеваний. Диагностика отличается высокой точностью, поэтому практически не дает ошибок и ложных результатов. Анализ часто назначается, как дополнительное обследование, чтобы выявить конкретный тип вируса или микроба.
Достоинства и недостатки метода ПЦР
Анализ ПЦР – результативный диагностический инструмент, позволяющий врачу не только правильно определить тип инфекционного возбудителя в организме больного, но также и количество микробов. Эта особенность позволяет методу ПЦР эффективно обнаруживать и хронические инфекции, к примеру, вирусный гепатит.
Преимущества методики заключаются в следующих особенностях:
Недостатки ПЦР-диагностики – это необходимость в высокотехнологичном оборудовании и высококвалифицированных специалистах. Для анализа нужен специальный бокс-ламинар, где поддерживается необходимая температура и обеспечивается чистота эксперимента.
Как сдать анализ ПЦР правильно: подготовка
Чтобы понять, как именно следует подготовиться к предстоящему анализу ПЦР, пациент должен обязательно уточнить у своего врача, какой именно биологический материал планируется взять. От этого непосредственно зависит подготовка.
Мазок у женщин
Мазок у мужчин
Подготовиться к забору мазка из мочеиспускательного канала для проведения ПЦР несложно. Достаточно соблюдать изложенные ниже правила.
Анализ крови
Если в процессе ПЦР анализа объектом изучения станет кровь пациента, правила подготовки к нему следующие.
Как проводится тест ПЦР?
Для исследования берется любая среда, в которой может находиться возбудитель, но чаще всего используются:
При одном взятии материала можно обнаружить сразу нескольких возбудителей, попавших в организм. Такая универсальность избавляет пациента от дополнительных обследований и лишних трат.
Обнаружить и идентифицировать участки генетической информации удается при помощи специальных эталонных маркеров ДНК (праймеров) созданных для каждого известного возбудителя. Эталон позволяет найти «свой» фрагмент среди миллионов других. Если это происходит, запускается реакция полимеразной цепи.
» data-image-caption=»» data-medium-file=»https://i1.wp.com/medcentr-diana-spb.ru/wp-content/uploads/2017/01/ptsr-analiz.jpg?fit=422%2C300&ssl=1″ data-large-file=»https://i1.wp.com/medcentr-diana-spb.ru/wp-content/uploads/2017/01/ptsr-analiz.jpg?fit=662%2C471&ssl=1″ loading=»lazy» src=»https://i1.wp.com/medcentr-diana-spb.ru/wp-content/uploads/2017/01/ptsr-analiz.jpg?resize=662%2C471″ alt=»пцр анализ» width=»662″ height=»471″ srcset=»https://i1.wp.com/medcentr-diana-spb.ru/wp-content/uploads/2017/01/ptsr-analiz.jpg?w=662&ssl=1 662w, https://i1.wp.com/medcentr-diana-spb.ru/wp-content/uploads/2017/01/ptsr-analiz.jpg?resize=422%2C300&ssl=1 422w» sizes=»(max-width: 662px) 100vw, 662px» data-recalc-dims=»1″ />
ПЦР—реакция делает огромное число копий выявленного участка генной информации (репликацию). Важно, что реплицируются только участки ДНК и РНК, необходимые для проведения анализа. Поэтому так важны чистота эксперимента и умение персонала обращаться с аппаратурой и образцами.
Цепная реакция протекает очень быстро, уже через два часа участок ДНК увеличивается в миллионы раз, что позволяет обнаружить и точно идентифицировать инфекцию. Для работы с эталонами пробирки помещают в специальный прибор. При помощи программы задается алгоритм, несколько раз меняющий температуру среды и влияющий на протекание реакции. Результат ПЦР виден сразу после окончания исследования.
Как расшифровать ПЦР анализ
Проведение ПЦР исследования позволяет не просто установить тип инфекции, присутствующий в организме больного, но и оценить его с количественной точки зрения (количество микробов). Расшифровка результатов количественного анализа ПЦР играет важную роль в обнаружении и проверке эффективности лечения большого числа хронических заболеваний, скажем гепатита C.
Результатом анализа ПЦР могут стать положительный и отрицательный ответы.
Иногда инфицирование выявляется на фоне полного здоровья и отсутствия признаков заболевания. Некоторые больные считают, что анализ сделан неправильно, но реальная ситуация другая. Если ПЦР показала, что возбудитель в организме есть, значит, он там действительно находится. Просто инфекционные болезни никогда не начинаются сразу после заражения, имея инкубационный период различной продолжительности.
Скрытый период может продолжаться очень долго, например, при СПИДе – несколько лет, пока какие-то механизмы не подтолкнут вирусы к размножению. Возбудитель определяется в организме носителей и тех, кто не долечился. Очень часто переходят в скрытую (латентную) форму различные ЗППП. В этом случае может понадобиться дополнительная лабораторная диагностика.
Точность расшифровки результатов ПЦР анализа
Метод ПЦР, позволяющий выявлять достаточно большое число инфекций, характеризуется повышенной точностью, чувствительностью и специфичностью. Эти характеристики говорят о том, что с помощью исследования ПЦР можно:
Преимущества метода ПЦР над иммуноферментным анализом и прочими иммунологическими инструментами выявления инфекции заключается в том, что он реже дает ошибочные результаты. То есть расшифровка анализа ПЦР значительно реже показывает отсутствие инфекционных микробов, если они есть в организме больного.
Кроме того, почти не бывает, чтобы расшифровка анализа выявляла наличие в организме несуществующей инфекции, то есть давала ложноположительные результаты.Разумеется, стопроцентно правильными результаты ПЦР назвать все же нельзя, поэтому необходимо обязательно дополнять это исследование другими методиками.
Принцип ПЦР исследования
Что такое полимеразная цепная реакция (ПЦР)? Практически каждый человек в жизни сталкивается с этим методом, даже если не знает об этом. ПЦР исследует генетический материал – ДНК или РНК. Благодаря открытию ПЦР медицина и наука вышли на новый уровень и стала возможной точная диагностика различных инфекций, наследственных и онкологических заболеваний, установление отцовства и даже клонирование генов. ПЦР широко используется в криминалистике, раскопках и других областях, поскольку источником ДНК может быть капля крови, оставленная на месте преступления или человеческий волос, и даже останки мумии или мамонта, пролежавших тысячи, миллионы лет…
Но сегодня нас будет волновать ПЦР как точный метод диагностики инфекционных заболеваний, где он заслуженно удостоен звания «золотой стандарт». В основе метода – поиск ДНК микроорганизмов, то есть точное установление «личности» микроба, ставшего причиной заболевания.
Как работает ПЦР?
Всем известно из курса биологии, что генетический материал всего живого на Земле представлен двухцепочечной молекулой ДНК (кроме некоторых вирусов, содержащих РНК). Каждая цепочка ДНК состоит из комбинации четырех нуклеотидов. Да-да, нуклеотидов всего 4, но из них составлен генетический материал всех живых существ. Разница лишь в определенной последовательности нуклеотидов в цепочках ДНК. Зная уникальный порядок нуклеотидов в участке ДНК искомого микроорганизма, возможно его выявить в любом биологическом материале.
Принцип ПЦР заключается в многократном удвоении (амплификации) участка ДНК при помощи специальных ферментов.
Почему реакция называется полимеразная цепная?
В чём преимущества ПЦР?
Для грамотного применения метода следут запомнить следующие моменты:
ПЦР выявляет ДНК возбудителя независимо от того, живой он или мёртвый, поэтому:
Для выявления ДНК внутриклеточных инфекционных агентов ( например, вирусов) нужны клетки, поэтому:
Слизь, кровь и гной могут заблоктровать реакцию ПЦР, поэтому:
Проведение ПЦР требует строго соблюдения условий технологии, поэтому в лаборатории KDL:
Будьте здоровы и обследуйтесь в лаборатории, которой доверяете!
Сколько стоит сдать ПЦР-анализ
Я пять лет работал в государственной медицинской лаборатории.
По опыту знаю, что пациентам бывает непросто разобраться с тем, какие тесты им нужно сдавать, да и нужно ли вообще. В этой статье расскажу, что такое ПЦР-анализы и можно ли на них сэкономить.
Сходите к врачу
Наши статьи написаны с любовью к доказательной медицине. Мы ссылаемся на авторитетные источники и ходим за комментариями к докторам с хорошей репутацией. Но помните: ответственность за ваше здоровье лежит на вас и на лечащем враче. Мы не выписываем рецептов, мы даем рекомендации. Полагаться на нашу точку зрения или нет — решать вам.
Что такое ПЦР-тесты и зачем их сдавать
В отличие от криминалистов, врачей обычно интересуют две вещи:
Но генетические анализы нужны не так уж часто, поэтому в статье мы будем говорить про ПЦР-анализы на инфекции.
Как работает ПЦР-анализ. У большинства живых существ на нашей планете, за исключением некоторых вирусов с РНК-геномами, генетический материал представляет собой длинную двухцепочечную молекулу ДНК.
Цепочка ДНК состоит из «звеньев» — нуклеотидов. Это четыре небольшие молекулы, строение которых универсально для всех живых существ. Из одного и того же набора нуклеотидов можно собрать геном вируса оспы, человека или синего кита. Вся разница — в порядке, в котором нуклеотиды идут в цепочке ДНК. Зная уникальный порядок нуклеотидов для участка ДНК какой-нибудь болезнетворной бактерии, мы можем засечь его присутствие в биологическом материале. А поскольку этот порядок уникален, мы не перепутаем его с человеческой ДНК.
Во время полимеразной цепной реакции кусочек чужеродного генетического материала из образца при помощи особого белка-фермента размножают много-много раз. В результате получается столько ДНК, что ее хватает для успешной идентификации.
Для каждого микроорганизма набор реактивов нужен свой. Поэтому врачи назначают не ПЦР-анализ вообще, а исследование на конкретный микроорганизм. Так что ПЦР-тест на гепатит С не поможет найти в образце еще и хламидии.
ПЦР-анализы бывают качественные и количественные. Качественные позволяют понять, есть ли в образце генетический материал бактерии или вируса, который мы ищем. А количественные — сколько именно там этого материала. Если сделать несколько таких тестов во время лечения, станет ясно, действует ли на микробов назначенное лекарство.
Как подготовиться к ПЦР-анализу
Чтобы выяснить, какая инфекция поразила человека, у него обычно берут кровь, мочу, образцы клеток слизистой из ротоглотки или с шейки матки.
В России кровь по умолчанию рекомендуется сдавать натощак, не менее чем с интервалом в 8—12 часов после приема пищи. Однако за рубежом таких строгих правил нет: считается, что перед походом в лабораторию можно позавтракать без сладкого и жирного, например кашей без сахара и масла, куриной грудкой или яйцом. Так что если у вас был легкий завтрак, кровь сдавать можно. Пить тоже не запрещено, но лучше ограничиться чистой водой без газа.
Если в качестве материала выступает моча, ее нужно собирать утром, как только проснетесь, в чистый контейнер для анализов или в вымытую с мылом банку из-под детского питания.
Правила, по которым нужно сдавать мазок на ПЦР из половых органов, отличаются для мужчин и для женщин. Всем за 1—2 дня до исследования нужно отказаться от секса, а в течение 1,5—2 часов перед исследованием — воздерживаться от мочеиспускания. Женщинам за сутки до процедуры не следует проводить спринцевание, пользоваться свечами и антисептиками для подмывания. Во время менструации сдавать биологический материал нельзя.
Можно ли верить ПЦР-тесту
Ни один лабораторный тест не обеспечивает абсолютной точности, всегда есть вероятность ошибки. Причем ошибиться тест может в обе стороны: либо не найти искомую инфекцию у пациента, которой он на самом деле заражен, либо обнаружить ее у человека, болеющего чем-то другим или вовсе здорового.
При этом ПЦР-анализы зачастую точнее других методов поиска возбудителя инфекционных заболеваний. Например, возбудителей гонореи у женщин можно искать под микроскопом, можно выращивать в чашке Петри, а можно определять методом ПЦР. В первом случае чувствительность анализа в пределах 36,2%, во втором — 89,7%, а в третьем — 89,9—100%. Получается, что ПЦР-анализ — самый надежный, и доверять ему можно. Примерно так же дела обстоят и с другими половыми инфекциями.
Информативность ПЦР в диагностике инфекций, передаваемых половым путемPDF, 152 КБ
Однако есть и относительно новые, менее надежные варианты ПЦР-тестов — например, на коронавирусную инфекцию. По словам Дениса Проценко, главного врача инфекционной больницы в Коммунарке, чувствительность тестов для выявления COVID-19 — 70—80%. Согласно китайским данным, чувствительность теста может быть еще ниже — в пределах 66—80%.
Но здесь многое зависит от времени взятия образца. Если мазок из горла взяли через 3—4 дня после появления симптомов, то вирус уже мог успеть спуститься из ротоглотки в легкие, и тогда вероятность найти его в мазке составляет всего 40%.
Хотя ПЦР-тесты на коронавирус работают хуже, чем ПЦР-тесты на половые инфекции, ничего точнее для диагностики коронавирусной болезни у нас пока нет. Врачи назначают повторный тест, если у них по результатам диагностики остаются сомнения.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР): что это за метод, как работает, компоненты реакции, применение ПЦР, преимущества
Наверное, каждый врач сталкивался в своей практике с такими случаями — никакой явновыраженной сиптоматики, микробиологические исследования — в пределах нормы, а у пациента температура две недели не падает, или простатит рецидивирующий, или еще какая-то болячка, с которой не удается справиться.
А истинную причину выяснить ну никак не удается.
Мистика? Непрофессионализм? Нет.
Это недостатки диагностики. Иногда вирус или бактерия могут находиться в крови столь малых количествах, что чувствительность традиционных методов диагностики не позволяет их выявить.
А они, тем временем, делают свое темное дело, нанося порою непоправимый вред организму. Но ситуация меняется. теперь на вооружении у врачей есть тонкий высокочувствительный метод диагностики — полимеразная цепная реакция (ПЦР).
В настоящее время ПЦР является самым чувствительным и самым точным методом диагностики инфекционных заболеваний.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, который позволяет получить значительное увеличение количества определенных участков ДНК из биологических проб, в которых исходная ДНК содержится в сверхмалых количествах.
Первые опыты по амплификации ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК, названных праймерами, проводил еще норвежский ученый Хьеллю Клеппе в 70-е годы прошлого столетия. Но его идея так и осталась нереализованной. И только спустя почти десять лет, в 1983 году полимеразная цепная реакция была открыта американским биохимиком Кэри Муллисом. Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНКполимеразы. Первая публикация по методу ПЦР появилась в ноябре 1985 года в журнале Science. А через восемь лет К.Муллис получил Нобелевскую премию за открытый им метод.
ЧТО такое ПЦР
Каждый живой организм имеет определенный набор специфичных, присущих только ему участков ДНК. Метод ПЦР позволяет найти в исследуемом материале среди огромного количества генетической информации именно такие специфичные участки и многократно их размножить.
Метод ПЦР основан на принципе естественной репликации ДНК, включающем расплетение двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и комплиментарное дополнение обеих. Репликация ДНК начинается только в определенных местах, где расположены стартовые блоки, а не в любой произвольной точке.
Суть метода заключается в том, что маркировав стартовыми блоками специфичные участки ДНК, характерные только для данного вида, можно многократно воспроизвести (амплифицировать) именно этот участок ДНК. В результате нарабатывается достаточное количество генетического материала для последующей детекции. Метод ПЦР настолько точен, что он позволяет не только выявлять наличие ДНК возбудителя в биологической пробе, но и точно установить его количество и генотипическую принадлежность.
КАК работает ПЦР
В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, с помощью ПЦР можно амплифицировать относительно короткие участки ДНК, длиной не более 3000 пар оснований. Используя смеси различных полимераз, специальных катализаторов и соблюдая особые условия, исследователям удавалось амплифицировать с помощью ПЦР фрагменты ДНК длиной 20-40 тыс. пар оснований. Но это все равно ничтожно мало в сравнении с длиной хромосомной ДНК эукариотической клетки. Геном человека, например, состоит примерно из 3 млрд. пар оснований.
Для того, что бы провести анализ методом ПЦР, необходимо иметь в наличии короткие одноцепочечные участки ДНК, специфичные для данного вида возбудителя, называемые «праймерами».
Но специфичного участка длиной в несколько тысяч оснований вполне достаточно, что бы дифференцировать тип возбудителя.
Для проведения ПЦР вначале исследуемый материал нагревают до температуры денатурации, добиваясь того, что бы двухцепочечные молекулы ДНК исходного материала разделились на одиночные нити. Затем вносят праймеры. При внесении праймеров в раствор с исследуемым материалом, праймеры начинают «прочесывать» раствор в поисках участков, к которым они являются комплиментарными. Если такие участки найдены – то праймеры присоединяются к ним, образовав стартовые двухниточные участки.
После присоединения праймера (этот процесс называют «отжиг») начинается синтез маркированного специфического участка ДНК с помощью специфического фермента – Taq-полимеразы, который получают из термофильных бактерий.
Вновь синтезированные фрагменты ДНК становятся матрицами для синтеза новых участков ДНК в последующих циклах амплификации. Поэтому такая реакция и называется цепной. В результате 25 циклов амплификации из одного участка ДНК синтезируется 106 копий. А после 30-40 циклов нарабатывается достаточное количество ДНК, что бы визуально учитывать результаты реакции после электрофореза в агарозном геле.
КОМПОНЕНТЫ реакции ПЦР
Проведение анализа исследуемого материала методом ПЦР состоит из 3 этапов:
Для проведения ПЦР необходимы следующие компоненты:
Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофильных бактерий – Thermus aquaticus (Taqполимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.
Содержит соли, бычий сывороточный альбумин. Может быть использовано высококипящее минеральное масло (например, вазелиновое). Но это зависит от амплификатора, в котором проводится реакция. Если это амплификатор с подогреваемой крышкой, исключающий испарение реакционного раствора, то масло в пробирку не добавляется.
Также необязательным компонентом является пирофосфатаза. Этот фермент катализирует гидролиз побочного продукта реакции – пирофосфата, который может ингибировать полимеразную цепную реакцию.
ПРИМЕНЕНИЕ ПЦР
ПЦР – диагностика универсальна. Для проведения анализа методом ПЦР используется любой биологический материал, в котором может содержаться ДНК возбудителя – слизи, моча, кровь, мокрота, соскобы и биоптаты.
широкое распространение получил метод ПЦР для выявления инфекций, передаваемых половым путем, особенно скрытых или хронических. Это такие инфекции как хламидиоз, гарднереллез, микоплазменная инфекция и пр. Это возбудители, которых сложно выявить классическим способом выращивания клеток в лабораторных условиях. Да и анализ антител в серологическом растворе может быть неточным.
А исследовав соскоб эпителия уретры или канала шейки матки, секрет простаты или мочу, можно с точностью установить наличие именно той или иной инфекции, так как размножению подвергается только ДНК бактерии, а не сама бактерия.
Также метод ПЦР незаменим для диагностики вирусных заболеваний. Кроме выявления наличия вируса в пробе, ПЦР позволяет определять генотип вируса. Что очень важно, например, при выборе методов лечения папилломавируса человека и прогнозирования развития заболевания, т.к. вирусы ВПЧ, принадлежащие к разным типам, обладают различной патогенностью и онкогенностю.
Также генотипирование важно при диагностике вирусных гепатитов. Метод ПЦР используется для контроля за эффективностью лечения при вирусных гепатитах. Для этого производится так называемый «количественный» анализ, который позволяет не только выявить наличие вирусной ДНК, но и с точностью определить количество вирусов, содержащихся в крови.
Не стоит забывать и о диагностике ВИЧ-инфекции.
Метод ПЦР нашел свое применение в пульмонологии, где он используется для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулеза, дифтерии.
Метод может быть применен для выявления хеликобактериоза в гастроэнтерологии, для определения цитомегаловирусной инфекции и онковирусов.
Но выявление инфекционных заболеваний, оценка их вирулентности и устойчивости к антибиотикам – это только одна из возможностей ПЦРдиагностики. Она позволяет также проводить генетическую дактилоскопию, пренатальную диагностику и многое другое.
Современные методы пренатальной диагностики или скрининга носительства призваны помочь решить проблему детской смертности и инвалидности, связанной с развитием у детей наследственных болезней, наследственной предрасположенности к некоторым видам смертельных недугов (например, к раку). Именно ПЦР является тем методом, который позволяет выявить поврежденные участки ДНК, связанные с точечными мутациями генов, и влекущие страшные последствия.
Несмотря на то, что ПЦРдиагностика является высокоспецифичным методом, при ней также возможны ложно-положительные результаты, связанные с попаданием в материал исследования чужой ДНК и ее копий через предметы и реагенты. Предупреждается это правильной организацией исследования и соблюдением ряда правил.
ПРЕИМУЩЕСТВА
Метод ПЦР стал «золотым стандартом» при диагностике ряда заболеваний.
Главное преимущества метода – это его чувствительность. ПЦР позволяет выявить возбудителей в тех случаях, когда из за сверхмалого количества они недоступны для других методов.
Благодаря особенности ПЦР, позволяющей выявлять даже единичные экземпляры возбудителей в биологическом материале, метод особенно ценен в диагностике латентных и хронических форм заболеваний.
Возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов очень сложно обнаружить другими методами, а ПЦР дает такую возможность.
Также огромным достоинством метода является его быстрота, т.к весь процесс, начиная с выделения вирусной или бактериальной ДНК из пробы, занимает всего несколько часов.
В то время, как трудоемкий метод выращивания визуализируемых колоний возбудителя в лабораторных условиях может занимать несколько дней. Практически полная автоматизация метода сводит к минимуму вероятность ошибок, связанных с ручной подготовкой и тестированием проб.
Метод эффективен при диагностике трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм патогенных бактерий.
Также метод может быть использован для тестирования объектов внешней среды.
Специфичность метода составляет 100%.
Метод используется не только в диагностике, но и в наблюдении за динамикой течения заболеваний, т.к. позволяет определять число копий возбудителя в пробе и, тем самым, контролировать виремию или бактеремию в процессе лечения. Что позволяет своевременно оценить эффективность лечения и произвести необходимые корректировки.
Очень важно, что при проведении исследования методом ПЦР практически исключается возможность инфицирования персонала во время проведения анализа, т.к. исследуемый материал может быть дезинфицирован химически или термически в момент забора.
Внимание! информация на сайте не является медицинским диагнозом, или руководством к действию и предназначена только для ознакомления.