Что такое постмортальный период
Что такое постмортальный период
Показателями интенсивности разложения трупа являются качественные и количественные характеристики его микрофлоры или некробиома. Труп является доступным источником азотсодержащей органики для микроорганизмов [1; 2], которые используют его в качестве источника питания и могут оказывать большое влияние на направленность разложения [3; 4]. Кроме того, доминантные эколого-трофические группы микрофлоры трупа представляют особый интерес для судебной экспертизы, поскольку способны выживать и расти благодаря активной конкуренции с некрофильными насекомыми, представляющими экологический комплекс деструкторов останков и экскрементов животного происхождения [5].
Целью работы являлось изучение специфики микробного разложения мертвых тел.
Материал и методы исследования. Для проведения исследования пробы отбирали из трупов домашних свиней (массой 50-100 кг), кур (массой 1,5-2 кг) и домовых мышей (массой 80 г). Всего изучено более 80 объектов, более 1000 изолятов микроорганизмов. Все эксперименты проводились с соблюдением соответствующих этических норм и правовых документов.
Микрофлору ложа и фрагментов органов и тканей трупа отбирали из наиболее подвергающихся микробной контаминации областей и в условиях асептики помещали в пробирки со стерильной транспортной средой. С костных останков трупов свиней посмертную микрофлору отбирали методом смывов. Методика сбора и микробиологического анализа смывов позволяет получить более точные результаты и определить присутствие характерных микроорганизмов в составе микрофлоры трупа. Смывы (протирая необходимые участки не менее 5 раз) собирали стерильными салфетками или ватными тампонами, которые предварительно смачивали стерильным изотоническим раствором. Параллельно измерялась температура трупа и окружающей его среды. Параллельно с отбором проб измеряли температуру и кислотность тканей трупа и окружающей среды.
Для выделения и идентификации Firmicutes и Gracilicutes использовали диагностические наборы «Микро-Желатиназа-Ницф», «Микро-Гинс-Ницф», «Микро-Циль-Нильсен-Ницф», «Микро-Каталаза-Ницф», «Микро-Цитохромоксидаза-Ницф», среды Блаурокка и Китт-Тароцци, короткий ряд Гисса, сульфатредуцирующий агар. Таксономическая идентификация производилась с использованием алгоритма определения вида по «Определителю бактерий Берги» (1997) [6].
Последовательную смену микроорганизмов некробиома изучали в естественных условиях и на антропогенно измененных территориях, оценивали по динамике эколого-физиологических профилей: протеолитиков, целлюлозолитиков, азотфиксаторов, прототрофов и сульфатредукторов. Дополнительно для них определяли и биохимические показатели.
Для изучения консорциума аммонификаторов посмертного микробиома использованы стандартные среды, реактивы и красители. Основными признаками их развития считали помутнение среды, образование пленки, осадка и положительные реакции на аммиак (NH3) с реактивом Несслера и на сероводород (H2S) с ацетатом свинца. Наблюдения проводили на первые, третьи, пятые и седьмые дни с момента посева. Реакцию на NH3 ставили на пятый-седьмой день. Морфологию и ультраструктуру клеток аммонификаторов учитывали на препаратах, выполненных по Граму, а разнообразие их определяли по культуральным макро- и микроскопическим признакам. Доминантные колонии с наиболее специфическими признаками исследовались бактериоскопически с помощью окраски по Граму.
Протеолитическую активность и свойства представителей доминантных видов посмертного микробиома, выделенных в чистую культуру, рассматривали на разных стадиях разложения трупов. При интерпретации полученных данных учитывали основные абиотические показатели на момент отбора проб.
С целью изучения многообразия физиологических групп микроорганизмов, ответственных за трансформацию костных останков, использован труп экспериментального животного, который помещали в природные условия для развития явлений гниения. Для наблюдения за интенсивностью разложения трупа и изменениями костной ткани проводился макроскопический анализ, в процессе которого фиксировались интенсивность гнилостной трансформации трупа, а затем и костных останков – наличие или отсутствие на костях мягких тканей, их цвет и структура, состояние костной пластинки, тяжесть, плотность и маслянистость костей. С помощью прибора «4В1 PН метра» оценивали изменение абиотических факторов в почве и трупе: морфологические и физико-химические свойства (кислотность, влажность, температура).
Затем кости в условиях лаборатории помещали в огородную почву с целью создания эффекта «почвенной ловушки» для участвующих в разложении костной ткани микроорганизмов. Опыты проводили при температурах +37, +21 и +5 °С. Микрофлору отбирали методом смывов стерильными тампонами, рандомно от 3 до 5 образцов. Микробиологический анализ осуществляли сразу после отбора проб путем суспензирования в физиологическом растворе, затем, в объеме 0,1 мл, инокулирования в среды, предназначенные для развития узких групп микроорганизмов, выполняющих определенную функцию в процессе диагенеза костных останков.
Для изучения процессов биогенной деструкции коллагена костной ткани проведена серия экспериментов по выделению в чистую культуру коллагеназ-продуцирующих бактерий родов Bacillus и Clostridium с использованием модифицированного метода агаровых блоков Н.С. Егорова [7]. Одновременно оценивали протеолиз желатины (60% гидролизата коллагена). Бактерии, обладающие ферментом желатиназой, подвергают гидролизу аминокислоты, входящие в состав желатина, в результате чего этот белок теряет свои желирующие свойства, приобретая жидкую консистенцию. Приготовление питательной среды для определения желатиназной активности выполняли с помощью набора реагентов «Микро-Желатиназа-Ницф» (021231): ГМФ бульон – 3,0; желатин – 12,0; Na2CO3 – 2,0. Чистые 18-часовые тест-культуры засевали уколом в пробирки с питательным желатином и помещали в термостат при +37±0,5 °С на 3–5 суток, перед учетом результатов посевы выдерживали в холодильнике 30 минут при температуре +3,0±2 С вместе с неинокулированной контрольной пробой. В случае с положительной желатиназной активностью отмечали расплавление желатина, а при отрицательной реакции – отсутствие расплавления.
В результате исследований по таксономическому разнообразию некробиомов получены данные о зависимости количества и качества идентифицированных таксонов Firmicutes и Gracilicutes от вида экспериментального животного, размеров трупа, биотопа его расположения, а также интенсивности и сроков разложения. Наибольшее разнообразие прокариотических микроорганизмов характерно для трупов свиней, некробиом которых содержал 24 рода фирмикутных и 14 родов грациликутных бактерий. Активные аммонификаторы среди них были представлены 5 родами. Наименьшее разнообразие вышеуказанных бактерий установлено для трупов куриц – 19 родов, из которых к активным аммонификаторам отнесены 4: Bacillus, Enterococcus, Clostridium, Pseudomonas. Полученные данные свидетельствуют об относительной стабильности ведущей микрофлоры, ответственной за процессы аммонификации (разложения) белков в составе трупного материала.
В результате исследования эколого-трофического разнообразия микроорганизмов в составе микрофлоры трупа выделены пять эколого-трофических групп, принимающих активное участие в разложении мертвого вещества: протеолитики, целлюлозолитики, азотфиксаторы, прототрофы, сульфатредукторы. В составе исследуемых микробных сообществ не выявлено олигонитрофилов и олигокарбофилов, что означает незавершенность процессов микробной минерализации органического вещества к 58 суткам разложения трупного материала. Каждую эколого-трофическую группу представляли таксоны микроорганизмов, которые имеют определенный набор ферментов, активирующийся на ранней или на поздней стадии разложения трупа.
Для описания динамики численности и структуры доминантных видов микроорганизмов в разные периоды разложения трупа выполнено распределение видов по шести жизненным формам: анаэробные хемоорганотрофы; аэробные хемоорганотрофы; аэробные хемоорганотрофы, активные аммонификаторы; факультативные анаэробы; хемоорганотрофы, денитрификаторы; аэробные фиксаторы молекулярного азота; аэробные аутотрофы, окисляющие аммиак до азотистой кислоты. Выявлена закономерность: чем специфичнее условия среды, тем беднее биоразнообразие бактерий в составе некробиома и выше численность отдельных физиологических групп.
В результате изучения ферментативной активности выделенных групп микроорганизмов установлено, что наибольшая доля приходится на виды с фосфатазной активностью (до 59,4% в зависимости от срока разложения), протеолитиков (до 52,8% в зависимости от срока разложения) и виды с декарбоксилазной активностью (до 27,2% в зависимости от срока разложения). Доля сульфатредукторов в исследуемых микробных сообществах оказалась самой незначительной (до 13,3% в зависимости от срока разложения).
Примечательно, что доля биохимически активных групп микроорганизмов исследуемых биотопов в процессе разложения трупов стабильно увеличивалась независимо от срока разложения и колебаний температуры окружающей среды. За период исследования доля протеолитически активных микроорганизмов увеличилась в 1,5 раза, доля гликолитически активных – в 1,7 раза; обладающих фосфатазной активностью – в 2,8 раза, нитрогеназной – в 1,6 раза, декарбоксилазной – в 2,3 раза, сульфатредуцирующей – в 1,8 раза.
Судебно-медицинское значение полученных экспериментальных данных по закономерностям изменения состава эколого-трофических профилей некробиома заключается в том, что из всех изученных параметров ферментативная активность микроорганизмов является наиболее чувствительным критерием, позволяющим разработать альтернативные подходы к объективной оценке срока давности наступления смерти [8].
Установлено, что в путрификации ведущую роль играют микроорганизмы, ответственные за гнилостный распад белков или аммонификацию [9]. Установлена относительная стабильность их ведущей микрофлоры в составе изученных образцов трупа и его ложа. Аммонификаторов в составе некробиома домашней свиньи обнаружено десять протеолитически активных штаммов, у курицы и домовой мыши – по восемь. При исследовании активности протеолитических ферментов у бактерий определено, что наибольшая способность вызывать разложения азотсодержащих органических соединений трупного материала характерна представителям родов Bacillus, Clostridium и Pseudomonas. Среди них установлены доминирующие, а также и малочисленные и редкие виды бактерий. Подтверждено, что в процессе гниения органики трупного материала происходит снижение общего числа видов, численность отдельных таксонов резко увеличивается, и получают возможность свободно размножаться наиболее конкурентоспособные.
Большинство выделенных физиологических групп находятся в постоянной динамике, что, вероятно, связано с неравномерным распределением в почве органических веществ, образующихся в разное время в процессе микробной трансформации костных фрагментов. Исключение составила группа споровых аммонификаторов, которая на протяжении 7 месяцев модельного эксперимента, независимо от давности наступления смерти и температуры окружающей среды, развивалась стабильно, и её доля от общей численности микроорганизмов всегда была значительной (от 20,5 до 39,1%).
Анализ качественных и количественных характеристик данных групп микроорганизмов дает возможность не только оценить интенсивность происходящих процессов во времени, но и в зависимости от таких факторов среды, как кислотность почвы и температура окружающей среды. Полученные данные могут быть использованы в качестве инструмента исследования для оценки времени наступления смерти (посмертного интервала), расследования причин смерти, а также определения местонахождения захороненных трупов.
После смерти трупы являются доступным источником азотсодержащей органики, они не только колонизируются микроорганизмами, которые представляют нормальную микрофлору человека, но также и видами, которые обычно не способны колонизировать живые ткани или колонизируют их при определенных условиях [10; 11]. К таким видам относятся Bac. mycoides, Bac. subtilis, Cl. putrificum и Cl. sporogenes, которые в основном обитают в почве, контролируя процессы биогеохимической трансформации азота. С помощью серии выполненных исследований по изучению коллагеназной активности бациллярно-клостридиального комплекса микроорганизмов доказано, что ферменты бактерий, обнаруженных в составе некробиома, являются чувствительными молекулярными маркерами интенсивности разложения костных фрагментов. Установлено, что виды рода Bacillus и Clostridium способны гидролизовать коллаген в широких физиологических диапазонах рН и температуры.
Несмотря на зависимость метаболизма бацилл и клостридий от кислотности среды и температурного диапазона, изучение протеолитически активных видов, участвующих в разрушении костного коллагена, является перспективным для целей судебно-медицинской экспертизы, особенно в случае объективного установления позднего постмортального периода. Хотя использование ферментов бактерий в судебно-экспертной практике еще остается сложной задачей, применение их субстратной специфичности может существенно расширить доказательную базу проводимых экспертиз.
Выводы
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Статья подготовлена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках выполнения государственного задания.
Реализовано в рамках Программы развития опорного университета ФГБОУ ВО «Петрозаводский государственный университет» на период 2017-2021 годов.
Особенности морфологических изменений тканей в зоне повреждений, происходящих в постмортальном периоде
Publication in electronic media: 10.04.2011 under http://journal.forens-lit.ru/node/242
Publication in print media: Актуальные вопросы теории и практики судебно-медицинской экспертизы, Красноярск 2007 Вып. 5
О. Ю. Берг, Ю. С Исаев, М. В. Пикулева
Общеизвестно, что тупая травма составляет значительную как социально-экономическую, так и правовую проблему, разработка которой требует определенных усилий судебно-медицинских экспертов, особенно в части изучения диагностического значения травматического процесса в тканях для установления самого факта механического воздействия на тело человека, а также для определения прижизненности и сроков давности формирования механических повреждений. При расследовании уголовных дел, связанных с тупой травмой, на разрешение экспертизы всегда стоит вопрос о прижизненности и сроках давности образования повреждения.
Для судебно-медицинской экспертизы телесных повреждений это означает изучение особенностей морфологических изменений тканей. Однако, на основании одних только морфологических признаков определить срок давности и прижизненности причинения механических повреждений оказывается затруднительным.
Особые трудности возникают при дифференцировании прижизненных повреждений от посмертных, если они нанесены в ранние сроки (первые часы) премортального, либо постмортального периодов. Это обусловлено тем, что реактивные изменения тканей в области прижизненной травмы, как правило, не успевают четко проявиться, а также тем, что в посмертных повреждениях в связи с переживаемостью тканей возможно появление морфологических изменений, схожих с прижизненными. Кроме того, решение вопроса о прижизненности тканей и давности причинения повреждений затруднено еще и потому, что реактивные изменения в тканях не имеют строгой временной зависимости, так как реакция организма на травму связана с влиянием множества факторов, которые практически невозможно учесть.
В последнее время, несмотря на попытки использования в экспертной практике большого количества новых разнообразных методов исследования (гистохимический, биохимический, морфометрический и т.д.), позволяющих, по мнению авторов, определить давность повреждения, их прижизненный, либо посмертный характер, оказались безуспешными, и решение этой проблемы на данный момент остается далеко не завершенным. Как правило, это связано с материально-техническими трудностями многих лабораторий, ограниченностью сроков исполнения экспертиз, большим количеством проводимых исследований, а также трудоемкостью проведения и большой материальной затратностью рекомендуемых методов исследования. Единственным, нашедшим достаточно широкое применение в судебно-медицинской практике является гистоморфо-логический метод [Науменко В.Г, Митяева Н.А., 1980]. Микроскопическое исследование объективно позволяющее диагностировать прижизненность и сроки давности повреждений, основано на выявлении неспецифических вазомоторных, воспалительных и пролиферативных реакций в области повреждений, а также регионарных и общих ответных реакций организма на травму.
В том числе имеет значение исследование морфологических изменений мягких тканей, так как именно мягкие ткани первыми встречаются с травмирующими факторами (агентами), именно их повреждение несет в себе диагностическую информацию о времени получения травмы.
В связи с вышеизложенным, целью нашей работы явилось изучение особенностей гистоморфологических изменений тканей в зоне постмортальных повреждений. Объектами исследований явились трупы лиц обоего пола, правильного телосложения, несколько повышенного питания, в возрасте 45-60 лет, погибших внезапно от ишемической болезни сердца. В раннем постмортальном периоде, спустя 4-6 часов после наступления биологической смерти в зону средней трети передней поверхности правого плеча наносили дозированные удары тупым твердым предметом (экспертной спец. линейкой, рассчитанной на получение идиомаскулярной опухоли при дозированных ударах для решения вопроса о давности наступления смерти).
Через 10-15 минут после причинения удара, в этой области образовывались выраженные кровоподтеки синюшного цвета. На разрезах в мягких тканях (в подкожно-жировой клетчатке и поверхностных слоях мышц), в проекции механического воздействия были выявлены темно-красные очаговые кровоизлияния.
Далее в динамике проводили не менее чем 5-ти кратное взятие материала из зоны повреждения для гистологического исследования. Материал для исследования был представлен в виде кусочков мягких тканей с периферии повреждений на границе с неповрежденной тканью. Забор исследуемого материала проводился через строго определенные промежутки времени с дальнейшим помещением их в фиксирующую жидкость (10% нейтральный формалин).
Обработку гистологического материала проводили по стандартной батарее восходящих спиртов с последующей заливкой в целлоидин. В дальнейшем срезы изготавливали на микротоме со стандартной окраской гематоксилин-эозином.
При микроскопическом исследовании на микроскопе Олимпус СХ 31 при увеличении в х150 и х600 изготовленных препаратов, с описанием гистологического материала по стандартизированной схеме, была выявлена следующая динамика морфологических изменений в зоне причиненных посмертных изменений.
Через 4-6 часов после причинения повреждений (спустя 8-12 часов после наступления смерти) в представленном срезе четко выявляли распространенные кровоизлияния, в которых эритроциты четко контурировались, при этом, в отдельных зонах определяли единичные лейкоциты.
Через 16-18 часов после нанесения повреждений (через 20-24 часа после наступления смерти) в тканях выявлены распространенные сливные кровоизлияния из четко контурирующихся эритроцитов, среди которых выявлено небольшое количество лейкоцитов.
Через 22-24 часа после нанесения повреждений (спустя 26-30 часов после наступления смерти) в пределах среза появляются негустые скопления лейкоцитов. В просветах сосудов отмечается отмещение эритроцитов от плазмы, в основной массе эритроциты выявляются с относительно четкими контурами.
Через 30-32 часа после формирования повреждений (спустя 34-38 часов после наступления смерти) в мягких тканях в зоне кровоизлияний местами выявляются эритроциты без четких контуров, увеличивается количество лейкоцитов.
К 40 часу после нанесения повреждений (спустя 44-46 часов после наступления смерти) в зоне кровоизлияний местами выявляются эритроциты с нечеткими контурами, на отдельных участках в виде гомогенного эозинофильного прокрашивания. В зоне кровоизлияний лейкоциты находятся в виде более и менее густых скоплений.
Таким образом, выявленные морфологические изменения в зоне посмертно нанесенных повреждений по своим гистоморфологическим показателям были схожи с изменениями, возникающими при повреждениях, сформированных прижизненно.
Следовательно, при конкретном решении вопроса о прижизненности и сроках давности причинения механического повреждения необходимо подходить с осторожностью, анализируя весь комплекс информационных данных макро- и микроскопического исследования, состояние подлежащих тканей, а также локализацию и количество повреждений. При этом необходимо учитывать длительность и силу травмирующего воздействия, вид, размеры, глубину механического повреждения, характер травмирующего предмета, индивидуальные особенности организма.
Что такое постмортальный период
Постмортальная биохимия является новым направлением в судебной медицине. Специфика этого биохимического направления заключается в изучении закономерностей развития метаболических процессов в мертвом теле, витальной и постмортальной корреляции патологических процессов, установлении диагностических критериев для определения причины и условий наступления смерти. Биохимические исследования нередко оказываются основными в изучении танатогенеза и дифференциальной диагностике в постмортальном периоде. В последнее время все более широко стали внедряться современные методы биохимии для использования в судебно-медицинских целях, что резко повышает уровень постмортальной диагностики. Под влиянием различных факторов, как внешних, так и внутренних, происходят метаболические изменения в организме. Главной задачей постмортальной биохимии является изучение различных показателей метаболизма после наступления смерти. Известно, что одни биохимические показатели в постмортальном периоде сильно изменяются, другие сохраняются без изменений. Изучение данных параметров и используется для выявления достоверных маркеров танатогенеза. Возможности постмортальной биохимии для диагностических целей изложены и рекомендованы в Приказе № 346н от 12 мая 2010 г. «Об утверждении Порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз в государственных судебно-экспертных учреждениях Российской Федерации». Вместе с тем для диагностических целей разработаны и другие методы постмортальной биохимии. Объектами исследований при этом являются различные биологические жидкости, а также ткани.
Стекловидное тело глаза (СТ) является доступным и удобным объектом исследования в постмортальной биохимии. Ранее СТ было использовано для установления давности наступления смерти, в диагностике отравлений алкоголем и наркотиками. СТ меньше подвержено нарушению водного баланса, окружено плотными оболочками, более устойчиво к гнилостным изменениям в постмортальном периоде. В связи с этим установлена высокая информативность показателей при исследовании СТ.
Известны способы постмортальной диагностики при сахарном диабете гипергликемической комы по содержанию в СТ глюкозы, ацетоуксусной кислоты при диагностике кетоацидоза [1; 2]. Что же касается диагностики гипогликемической комы, то известны способы ее диагностики по содержанию лактата в крови, а также содержанию глюкозы и лактата в СТ. Указанные биохимические методы просты и доступны для внедрения в практику [1; 3]. Исследование показателей углеводного обмена в СТ глаза в постмортальном периоде является достоверным и информативным методом, что подтверждено многочисленными исследованиями 6.
Цель исследования: использовать показатели углеводного обмена стекловидного тела глаза для оценки встречаемости гипогликемической комы в структуре причин смерти.
Материалы и методы исследования. Проведено скрининговое исследование за 2016-2018 гг. секционного материала больных, стоявших при жизни на учете с заболеванием сахарный диабет, и лиц пожилого возраста. Постмортально проведен биохимический анализ крови и СТ от 2291 больного СД и 418 лиц без данного заболевания на базе судебно-медицинской лаборатории Пермского краевого бюро судебно-медицинской экспертизы. Биохимические исследования биологического материала в судебно-медицинских целях имеют свои особенности, поэтому мы даем описание всех методик.
5 мл крови забирали из крупных венозных сосудов. В крови определяли содержание гликогемоглобина колориметрическим методом с тиобарбитуровой кислотой с использованием набора реактивов «Гликозилированный гемоглобин (GHB 100)» (Lachema, Чехия) в нашей, описанной далее, модификации, что служило критерием подтверждения наличия заболевания СД при жизни пострадавших (более 7,0 мкмоль фруктозы на грамм гемоглобина). Гликогемоглобин представляет собой продукт конденсации глюкозы и бета-цепи гемоглобина. Известно множество методов определения гликогемоглобина: хроматографические, колориметрические, флюорометрические, иммунологические, электрофоретические, изоэлектрофокусирования. Чаще используются методы колоночной хроматографии и колориметрические. Каждый из этих методов имеет свои преимущества и недостатки, а при оценке результатов для каждого метода используются свои референтные величины. При использовании данного метода определению не мешает ни лабильная форма гликогемоглобина, ни фетальный гемоглобин, а также возможно исследование гемолизированной крови, что часто наблюдается в постмортальном периоде.
Проведение анализа. Кровь центрифугировали и 0,3-0,5 мл эритромассы гемолизировали не менее 30 минут в 5,0 мл 0,04% раствора аммиака. Гемолизат центрифугировали 20 минут при 5600 g, после чего фильтровали. Определение общего гемоглобина проводили стандарным гемиглобинцианидным методом. Для этого 0,2 мл очищенного гемолизата вносили в 5,0 мл трансформирующего раствора. На спектрофотометре СФ-2000 проводили регистрацию оптической плотности через 30 минут (длина волны 540 нм). Для количественного определения фруктозы в опытной пробе 1,8 мл полученного гемолизата вносили в мерную пробирку, добавляли 0,3 мл концентрированной фосфорной кислоты и отмечали уровень жидкости. В отдельные пробирки вносили, соответственно, для контрольной пробы 1,8 мл дистиллированной воды, в качестве стандартного раствора 1,8 мл фруктозы в концентрации 250 мкмоль/л. Пробирки закрывали резиновыми пробками, тщательно встряхивали. Время инкубации 30 минут в термоблоке при 100 °С. После гидролиза пробирки охлаждали в холодной воде, контролировали первоначальный уровень жидкости и при необходимости доводили до метки дистиллированной водой. Далее добавляли по 0,6 мл трихлоруксусной кислоты в концентрации 2,45 моль/л, тщательно встряхивали содержимое пробирок. Центрифугировали 20 минут при 1600 g. Затем в отдельные пробирки, содержащие по 1,0 мл тиобарбитуровой кислоты в концентрации 50 ммоль/л, вносили по 2,0 мл полученного супернатанта. Инкубацию проводили в термоблоке при 37 °С в течение 40 минут. После охлаждения пробирок, используя спектрофотометр PD-303, проводили измерение оптической плотности при длине волны 443 нм.
Концентрацию гликогемоглобина GHB, мкмоль фр/г Hb (мкмоль фруктозы / г гемоглобина), вычисляли по формулам
где Сфр – концентрация фруктозы в гемолизате крови, мкмоль/л;
Hb – концентрация общего гемоглобина гемолизата, г/л;
Dоп – оптическая плотность опытной пробы;
Dst – оптическая плотность стандартного раствора фруктозы;
Сst – концентрация фруктозы в стандартном растворе, 250 мкмоль/л;
64,458 – миллимолярный вес гемоглобина, г;
5,2 – общий объем трансформирующего раствора и гемолизата, мл;
D540 – оптическая плотность раствора для определения общего гемоглобина;
44 – миллимолярный коэффициент экстинкции гемиглобинцианида;
0,2 – объем гемолизата для определения общего гемоглобина, мл.
Для получения 2 мл СТ делали шприцем прокол наружного угла глаза. Перед исследованием СТ центрифугировали 20 мин в пластиковых пробирках при 5600 g. Содержание глюкозы определяли глюкозооксидазным методом с использованием набора реактивов «Фотоглюкоза» («Импакт», Москва), лактата (молочной кислоты) – колориметрическим энзиматическим методом с использованием набора реактивов Lactic acid («Витал Диагностикс СПб», Санкт-Петербург).
Для определения глюкозы в пробирки наливали по 2,5 мл ферментно-буферного раствора реактива. Далее вносили по 0,15 мл жидкости СТ (опытные пробы), раствор глюкозы в концентрации 1,25 ммоль/л (стандарный раствор) и воды (контрольная проба). Пробирки инкубировали в термоблоке 40 минут при 37 °С. Пробирки несколько раз встряхивали в течение инкубации. Измеряли оптическую плотность стандартного раствора и опытных проб на спектрофотометре PD-303 при длине волны 495 нм относительно контрольной пробы.
Концентрацию глюкозы в стекловидном теле C, ммоль/л, вычисляли по формуле
где Dпр – оптическая плотность пробы;
Dст – оптическая плотность калибровочного раствора глюкозы;
1,25 – концентрация глюкозы в стандартном растворе, ммоль/л;
R – коэффициент дополнительного разведения пробы.
Для определения лактата в пробирки наливали по 2,0 мл ферментно-буферного раствора реактива. Далее вносили по 20 мкл жидкости СТ (опытные пробы), раствор молочной кислоты в концентрации 3,33 ммоль/л (стандарный раствор) и воды (контрольная проба). Пробирки инкубировали в термоблоке 20 минут при 37 °С. Пробирки несколько раз встряхивали в течение инкубации. Измеряли оптическую плотность стандартного раствора и опытных проб на спектрофотометре PD-303 при длине волны 505 нм относительно контрольной пробы. Перед исследованием проводится дополнительное разведение жидкости СТ в 10 раз. При наличии гипокомы разведение обычно не требуется.
Концентрацию лактата в стекловидном теле C, ммоль/л, вычисляли по формуле
C = (Dпр : Dст) ∙ 3,33 ∙ R (5)
где Dпр – оптическая плотность пробы;
Dст – оптическая плотность калибровочного раствора молочной кислоты;
3,33 – концентрация молочной кислоты в стандартном растворе, ммоль/л;
R – коэффициент дополнительного разведения пробы.
Результаты исследования и их обсуждение. Критерием наличия гипогликемической комы являлось отсутствие глюкозы и резкое снижение содержания лактата в СТ. Ранее нами было установлено, что содержание лактата в СТ ниже 10 ммоль/л при отсутствии в нем глюкозы является метаболическим маркером гипогликемической комы [1; 3]. Оказалось, что содержание лактата в трупной крови резко увеличено по сравнению с показателями у живых людей. Резкий подъем концентрации лактата, в 20-30 раз, происходит в агональный период. Незначительное увеличение отмечается и в постмортальном периоде, что связано с процессом гликолиза в эритроцитах. Наличие лактата в СТ обусловлено довольно быстрым током жидкости, обеспечивающим поступление и выведение веществ в СТ. В агональном периоде происходит быстрая экскреция лактата через ретинальные сосуды. Установлено, что чем длительнее период агонии, тем большее количество лактата выявляется в СТ. В среднем содержание лактата в СТ около 26 ммоль/л. В половине всех случаев наступления смерти в результате гипогликемической комы лактат в СТ не определялся.
Частота гипогликемической комы у лиц без наличия сахарного диабета