Что такое рекомбинантные белки
Рекомбинантные белки
Рекомбинантные белки получены с помощью генной инженерии, так же называемой сплайсингом генов или методом рекомбинантных ДНК. Путем помещения генов человека, животных или растений в генетический материал клеток бактерий, млекопитающих или дрожжей, эти микроорганизмы могут использоваться как продуценты белков для медицинских, научных и исследовательских целей.
Рекомбинантная молекула ДНК должна быть реплицирована много раз для получения материала для анализа и секвенирования. Производство множества идентичных копий молекулы ДНК называют клонированием. Клонирование проводится in vitro с помощью полимеразно-цепной реакции (ПЦР). Клонирование in vivo может проводиться у одноклеточных микробов (например, E. coli), одноклеточных эукариот (дрожжи) и в клетках культур тканей млекопитающих.
Рекомбинантные ДНК должны быть получены клеткой в форме, в которой она может быть реплицирована и экспрессирована. Это достигается путем помещения ДНК в вектор. Ряд вирусов (как в клетках бкатерий, так и в клетках млекопитающих) могут служить в качестве векторов.
Рекомбинантная ДНК также иногда называется «химерой» при соединении двух или более типов ДНК. Существует три различных метода получения рекомбинантной ДНК: 1. Трансформация. 2. Трансфекция фагов. 3. Трансформация в клетках дрожжей, растений и млекопитающих. В первом случае необходимо выбрать участок ДНК, который должен быть инсерцирован в вектор с помощью ДНК лигазы. Инсерт содержит селектируемый маркер, который обеспечивает идентификацию рекомбинантных молекул.
Значительные количества рекомбинантных белков производятся в клетках-хозяевах только при добавлении генов экспрессии. Экспрессия белков зависит от генов, окружающих интересующую ДНК, этот набор генов действует как сигнал, который запускает транскрипцию и трансляцию нужной ДНК в клетке. Эти сигналы включают промотор, сайт связывания рибосом и терминатор.
Рекомбинантная ДНК инсерцируется в экспрессионный вектор, который содержит промотор, сайт связывания рибосом и терминатор. Ген не должен содержать интронов человека, поскольку бактерии не распознают их и это может стать причиной преждевременной терминации, и синтез или сборка белка могут быть нарушены.
Белки содержат сайты связывания металлов, которые могут быть использованы для очистки рекомбинантных или природных белков. Шесть или более идентичных гистидиновых остатков действуют как сайт связывания металлов для очистки и экспрессии белков. Последовательность hexa-His называют His-концом, который может быть помещен на N-конец белка-мишени. His-конец содержит сайт расщепления для специфических протеаз. Рекомбинантные белки с His-концом очищены методом метало-хелат аффинной хроматографии на никелевых ионных колонках, рекомбинантные белки после элюированы из метал-хелатной колонки с помощью гистидина или имидазола. Затем очищенный белок с His-концом обрабатывают с помощью специфической протеазы для отщепления His-конца, или не обрабатывают, если His-конец не влияет на активный сайт белка.
Что такое ДНК-вакцины и с чем их едят?
Автор
Редактор
ДНК-вакцины относятся к типу принципиально новых биологических препаратов. С их разработкой связывают большие надежды на повышение эффективности профилактики не только заболеваний бактериальной, вирусной и паразитарной природы, но и аллергических, аутоиммунных и даже онкологических болезней. Более двадцати лет назад возникла идея использовать гены возбудителей заболеваний для активации защитных механизмов. Конструкция ДНК-вакцин гениально проста: главные компоненты в ней — вектор и целевой иммуноген. Но, несмотря на это, ДНК-вакцины не стоят на страже нашего здоровья: их не вводят пациентам в поликлиниках, они не продаются в аптеках.
Более сотни лет прошло с введения Л. Пастером термина «вакцина» (лат. vacca — корова) и более двух сотен — с легендарных экспериментов Э. Дженнера по прививанию коровьей оспы ребенку с целью предупреждения развития опасного человеческого варианта болезни. Принцип защитного действия введенных в организм ослабленных инфекционных агентов или их частей научным языком объяснили уже в XX веке: безопасный чужеродный антиген учит иммунную систему в дальнейшем быстро распознавать и уничтожать активного и опасного возбудителя с точно такими же антигенами*. Процесс часто сравнивают с раздачей фоторобота преступника сотрудникам полиции.
* — Хронологию разработки вакцин, информацию о влиянии вакцинации на характер эпидемий и численность человечества, доводы адептов движения антивакцинации и ответы на множество животрепещущих вопросов относительно целесообразности, пользы и вреда прививок можно найти в статье «Вакцины в вопросах и ответах» [1]. — Ред.
За 200 лет форма и содержание прививок претерпели существенные изменения: Дженнер инфицировал царапины содержимым оспинных пустул, Пастер облагородил процедуру, вводя ослабленных агентов шприцем, затем научились создавать вакцины из убитых и даже растерзанных возбудителей (сплит- и субъединичные вакцины), недавно начали использовать рекомбинантные вакцины, содержащие один или несколько антигенов (обычно белковых), синтезированных генно-инженерным путем. И вот в двери ВОЗ робко стучится новый плод, порожденный слиянием науки с фарминдустрией, — вакцина из нуклеиновых кислот [2].
Начало ДНК-вакцинологии связывают с работами Д. Танга (1992 г.), в которых была показана способность плазмидной ДНК, экспрессирующей гормон роста человека, индуцировать выработку антител.
В классическом варианте такие вакцины состоят из плазмидных ДНК, содержащих гены возбудителей инфекционных заболеваний (целевые гены, или иммуногены). Продукты данных генов способны вызывать развитие защитных реакций организма, выступая в этом случае в роли антигенов. Доставку ДНК в макроорганизм первоначально осуществляли в комплексе с катионными липидами, однако эффект от введения препарата чистой нуклеиновой кислоты оказался более выраженным. Введенная в организм ДНК проникает в клеточное ядро, превращая клетку в завод по производству вакцины. Такая ДНК длительное время существует вне хромосом без репликации, транскрибируется за счет ферментов хозяйской клетки и экспрессирует соответствующие гены, продукты которых вызывают формирование иммунитета (рис. 1).
Рисунок 1. Схематическое изображение процессов в клетке после проникновения ДНК-вакцины. Рисунок из «Википедии».
ДНК-вакцины сохраняются в организме 3–4 недели. За это время они успевают индуцировать Т- и В-клеточный иммунитет (рис. 2). Однако, несмотря на кажущуюся простоту, многие механизмы развития иммунного ответа на ДНК-вакцины остаются малоизученными [3].
Рисунок 2. Схема развития иммунного ответа на ДНК-вакцину. Рисунок из «Википедии».
Более чем 20-летняя эволюция ДНК-вакцин продолжается и сегодня. Прогресс в дизайне кодирующих антигены нуклеотидных последовательностей, в оптимизации состава (в том числе включение молекулярных адъювантов), в совершенствовании форм и физических методов доставки позволил второму поколению ДНК-вакцин преодолеть такие проблемы первого поколения, как низкий уровень трансфекции и недостаточная иммуногенность.
Сейчас разработки в области генетических вакцин проводятся во многих странах мира. В настоящее время сконструированы экспериментальные ДНК-вакцины для профилактики инфекционных заболеваний паразитарной (шистосомоз, лейшманиоз), бактериальной (хламидиоз, сибирская язва, микоплазмозы) и вирусной (бешенство, лихорадки Западного Нила и Эбола) природы. На разных стадиях доклинических и клинических испытаний находятся генетические вакцины против вирусов гриппа, гепатитов А и В, герпеса, кори, геморрагических лихорадок, ВИЧ, собачьей чумы, ящура, папилломавирусов, цитомегаловирусов. Столь интенсивное развитие данного направления вакцинологии, вероятно, уже в ближайшей перспективе обеспечит реальный выход в виде эффективных и безопасных вакцинных препаратов, рекомендованных для применения в здравоохранении и ветеринарии.
Чем же ДНК-вакцины хороши?
Но. всё хорошее имеет свои недостатки
Конструкция ДНК-вакцин
Для получения ДНК-вакцин ген, кодирующий продукцию иммуногенного белка, необходимо встроить в вектор, роль которого выполняют бактериальная плазмида или вирус [4]. Вектор не должен реплицироваться в клетках макроорганизма, поэтому может содержать только прокариотические сайты инициации репликации.
Для создания ДНК-вакцин используются хорошо изученные плазмиды грамотрицательных бактерий (в основном E. coli), в частности многокопийная pUC19 или pBR322 и их производные. Разработаны специальные векторы для ДНК-вакцин — pcDNA3 и pcDNA3.1 (Invitrogen), которые содержат цитомегаловирусный (ЦМВ) промотор и сигнал полиаденилирования гена гормона роста быка. Также к коммерчески доступным плазмидам, которые чаще всего используются в качестве векторов для ДНК-вакцин, относятся: pVAX1 (Invitrogen), pCI, VR1012 DNA, pJW4303, pVAC1-mcs и pVAC2-mcs (InvivoGen). Последние две применяются для усиления гуморального иммунного ответа и содержат антигены к поверхностным структурам мышечных клеток [5].
Из числа вирусных векторов, обеспечивающих более высокий уровень экспрессии целевого антигена, чаще всего используются: дефектный по репликации аденовирус серотипа 5 (AD5), ортопоксвирусы и модифицированные вирусы осповакцины, альфавирусы. Аденовирусный вектор обладает высокой эффективностью трансфекции — до 100 %, в него можно включать до 8 т.п.н. ДНК. Отрицательный момент — синтез собственных белков, способных индуцировать иммунный ответ. Самые используемые осповакцинные модификации — Ankara (MVA) и New York Vaccinia strain (NYVAC). Первая получена в результате 56-кратного пассирования вируса в куриных эмбриональных фибробластах. В геноме NYVAC удалено 18 открытых рамок считывания, ассоциированных с диапазоном хозяев и вирулентностью. В каждый из перечисленных векторов можно встроить до 50 т.п.н. ДНК [6].
Элементы конструктора
Рисунок 3. Конструкция ДНК-вакцины на основе вектора pVAX1 с химерным геном (Rat cDNA, Human cDNA). Pcmv — цитомегаловирусный промотор; MCS — сайт для множественного клонирования генов; BGH pA — терминатор с сигналом полиаденилирования гена гормона роста быка; Kanamycin — ген устойчивости к канамицину; pUC ori — участок начала репликации плазмид группы pUC; HindIII, BstEII, XbaI — сайты рестрикции. Рисунок из [5].
Чтобы пригодиться для создания ДНК-вакцин, каждый уважающий себя вектор должен содержать необходимые конструкционные элементы (рис. 3).
Службы доставки
Способам введения ДНК-вакцин в организм уделяется не меньше внимания, чем созданию самих конструкций, так как от этого зависит успех иммунизации в целом. Поэтому разработаны различные, порой весьма хитроумные, методы доставки таких вакцин в организм.
Самый простой — это парентеральный способ введения, который заключается в инъекции ДНК-вакцин в солевом растворе (внутримышечно, внутрикожно). При этом бόльшая часть ДНК поступает в межклеточное пространство и только потом включается в клетки.
Использование генного пистолета. Для этого ДНК фиксируют на микроскопических золотых гранулах (около 1–2 мкм), а затем с помощью устройства, приводимого в действие сжатым гелием, гранулы «выстреливают» непосредственно внутрь клеток (рис. 4). Для данного способа доставки требуется значительно меньшее количество вводимого материала, чем для внутримышечной инъекции. Так, для инъекции мышам нужно 10-100 мкг препарата, а с использованием генного пистолета достаточно 0,1-1 мкг.
Электропорация — техника, которая с использованием электрических импульсов позволяет формировать поры в клеточной мембране и доставлять ДНК непосредственно в клетки.
Микроконтейнеры из полиматериалов. Московские ученые, например, создали пористую микросферу из карбоната кальция, покрытую несколькими слоями полисахаридов, в которую упаковывается молекула ДНК. Если микросферы в полимерной оболочке поместить в подкисленный раствор, карбонат кальция внутри растворится и уйдет через полимерную мембрану. Внутри останется только ДНК, подлежащая транспортировке. Подобных микроконтейнеров для доставки ДНК разработано не так много. Есть зарубежные аналоги, в которых оболочка капсулы выполнена из полимолочной кислоты. На их основе создают вакцины против гепатита и даже СПИДа. Средний диаметр микрокапсул для доставки ДНК-вакцин всего 1–2 микрона. Такие микрокапсулы можно ввести подкожно или даже в кровь. Если в микрочастицу вместе с ДНК или лекарством поместить фермент, расщепляющий оболочку капсулы изнутри, то высвобождением лекарства можно управлять: чем меньше фермента, тем медленнее рушится оболочка.
Липосомные носители обеспечивают высокую эффективность доставки при внутривенном введении, при этом экспрессия целевых генов значительно возрастает, так как осуществляется во многих органах, и особенно в селезенке.
ДНК-вакцины можно вводить перорально с использованием бактериальных носителей. Для этих целей применяются, например, модифицированные бактерии Shigella flexneri с делецией в гене asd. Мутантные бактерии растут in vitro на среде с диаминопимелиновой кислотой и, проникая в эукариотические клетки, не размножаются в них, так как отсутствует упомянутая кислота, а продуцируют закодированные в плазмиде антигены [6]. Для перорального введения создан вектор на основе ослабленного штамма Salmonella, который способен к самоуничтожению в организме через определенный период времени после выполнения иммунизационных задач. Для этого бактерию модифицировали таким образом, что ее выживание стало зависеть от наличия искусственных сахаров, не встречающихся в условиях организма. После того как в клетках, зараженных генно-инженерным штаммом Salmonella, заканчивается запас специфического сахара, поставляемого вместе с вакциной, бактерии не способны сохранить целостность своих клеточных стенок, что приводит к их гибели [11].
Была предложена оригинальная система доставки ДНК с помощью «теней» — неживых клеток грамотрицательных бактерий, лишенных цитоплазматического содержимого, но сохраняющих морфологию и антигенные структуры, включая адгезивные факторы. «Тени» обладают тропностью к антигенпрезентирующим клеткам макроорганизма и адъювантными свойствами, усиливающими иммунный ответ. Кроме того, в лиофильно-высушенном состоянии препараты «теней» хранятся при комнатной температуре неопределенно долгое время, а их производство дешево [6].
Разработана технология доставки ДНК-вакцин с использованием бактериофагов [12]. В данном случае вакцинная ДНК встраивается в геном вектора-бактериофага, которым затем иммунизируют макроорганизм [13].
Нужно учитывать, что разные методы доставки ДНК-вакцин в организм обеспечивают развитие различных клеточных реакций, при этом важные иммунологические пути могут быть стимулированы или, наоборот, не задействованы в ходе развития защитного ответа. Способы и места введения ДНК-вакцин варьируют для разных видов организмов. Например, уши свиньи — отличное место для инъекций, а вот введение препарата в уши овец или коров неэффективно.
Помощники генетических вакцин
Для усиления иммунного ответа, вызванного ДНК-вакцинами, совместно с ними вводят различные адъюванты, например, плазмиды, кодирующие синтез цитокинов, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора и других костимуляторных молекул (B7.1 (CD80), B7.2 (CD86) и CD40) [14].
Для ДНК-вакцины против ВИЧ создана конструкция, которая обеспечивает получение более высокого титра антител и его сохранность в течение более длительного времени по сравнению с обычной ДНК-вакциной. Эта молекулярная вирусоподобная конструкция представляет собой частицы диаметром 25-30 нм, содержащие в центре полинуклеотидный комплекс — рекомбинантную плазмиду pGEX-2T-TBI с генами инфекционного агента ВИЧ-1 или двухцепочечную РНК, которая является стимулятором неспецифической резистентности организма. На поверхности конструкции располагаются гибридные белки, содержащие эпитопы ВИЧ-1 и фермент (например, глутатион-S-трансферазу или галактозидазу). Связь между полинуклеотидным комплексом и гибридными белками осуществляется посредством конъюгата: спермидин (для связи конъюгата с полинуклеотидным комплексом) — полиглюкин — субстрат для фермента (например, глутатион или галактопиранозид; для аффинной сорбции гибридных белков на конструкцию).
Современное состояние ДНК-вакцинологии
В настоящее время в разработке находится около 420 ДНК-вакцин против заболеваний различной этиологии как человека, так и животных.
Бόльшая часть разрабатываемых противоинфекционных терапевтических ДНК-вакцин нацелена на ВИЧ-1. Существенные успехи достигнуты в активной иммунизации против вируса папилломы человека. Некоторые вакцины находятся на стадии клинических испытаний и, возможно, в скором времени будут введены в обязательную практику. Так, американская компания Inovio, специализирующаяся на разработке ДНК-вакцин, создала препарат против цервикальной дисплазии VGX-3100, который проходит вторую фазу клинических испытаний. В 2013 г. VGX-3100 удостоилась награды «Лучшая терапевтическая вакцина» на Всемирном конгрессе по вакцинам. В I или IIа фазах клинических испытаний находятся: вакцины против гепатита С, цервикального рака, рака головы и шеи, СПИДа, гриппа. Компанией Inovio также ведется активная разработка вакцин против лихорадки Эбола* и рака простаты.
* — О более привычном, но не менее перспективном методе борьбы с вирусом Эбола — с помощью «коктейля» из моноклональных антител — читайте в статье «Вирус Эбола и макак-резус: получено новое эффективное лекарство» [15]. — Ред.
Разработке способов вакцинотерапии онкологических заболеваний при помощи рекомбинантных ДНК большое внимание уделяют и другие организации. Хорошую эффективность показала ДНК-вакцина против лейкемии, созданная в Саутгемптонском университете (но вводимая с помощью электропоратора всё той же Inovio). Вакцина направлена на подавление в организме активности гена WT1 (Wilms tumor gene). Именно повышенная активность этого гена отмечается в опухолевых клетках различных видов. В ходе I фазы клинических испытаний у пациентов наблюдалось развитие иммунного ответа, в том числе активация Т-киллеров и выработка антител; была также доказана безопасность новой вакцины. Испытания перешли в фазу II, однако из-за проблем с финансированием организаторы пока не могут увеличить число участников [16].
Животные нуждаются в такой же защите, как и люди. В связи с этим для ветеринарии разрабатываются ДНК-вакцины против бычьего и лошадиного герпесвирусов, собачьего вируса чумы, вируса классической свиной лихорадки, кроличьей папилломы, ящура, вируса инфекционного гемопоэтического некроза, вируса гриппа, вируса японского энцефалита, вируса бешенства, вируса везикулярного стоматита и т.д. [13]. Много ДНК-вакцин создается для борьбы с вирусными, бактериальными и эукариотическими патогенами рыб [17].
Активно разрабатываются ДНК-вакцины для повышения иммунитета птиц. Многокомпонентные ДНК-вакцины могут сократить количество прививок, необходимых во время короткой жизни птиц и позволят избежать риска увеличения вирулентности некоторых патогенов. В случае птицеводства проблема связана с тем, что вакцины вводятся в амниотическую жидкость яиц, которая обладает ДНКазной активностью, поэтому свойства ДНК-вакцины могут ухудшиться. Заключение ДНК в катионные липосомы, скорее всего, поможет решить эту проблему.
Из множества разработанных ДНК-вакцин на сегодняшний день лицензировано всего несколько, причем повезло в этом плане только животным (табл. 1).
Рекомбинантный белок: методы получения и применение
Белок является важным компонентом всех организмов. Каждая его молекула состоит из одной или нескольких полипептидных цепей, состоящих из аминокислот. Хотя информация, необходимая для жизни, кодируется ДНК или РНК, рекомбинантные белки выполняют широкий спектр биологических функций в организмах, включая ферментативный катализ, защиту, поддержку, движение и регуляцию. По своим функциям в организме эти вещества можно разделить на разные категории, такие как антитела, ферменты, структурный компонент. Учитывая важные функции такие соединения интенсивно изучались и широко применялись.
Вам будет интересно: Что такое в русском языке управление? Особенности и нормы управления в русском языке
В прошлом основным способом получения рекомбинантного белка было его выделение из природного источника, что, как правило, неэффективно и отнимает много времени. Недавние достижения в области биологических технологий молекул позволили клонировать ДНК, кодирующую определенный набор веществ, в вектор экспрессии веществ, таких как бактерии, дрожжи, клетки насекомых и клетки млекопитающих.
Проще говоря, рекомбинантные белки транслируются продуктами экзогенной ДНК в живых клетках. Их получение обычно содержит два основных этапа:
В настоящее время производство такой структуры является одним из самых мощных методов, используемых в медицине и биологии. Состав имеет широкое применение в исследованиях и биотехнологии.
Медицинское направление
Рекомбинантные белки обеспечивают важные методы лечения различных заболеваний, таких как диабет, рак, инфекционные заболевания, гемофилия и анемия. Обычные составы таких веществ включают антитела, гормоны, интерлейкины, ферменты и антикоагулянты. Существует растущая потребность в рекомбинантных составах для терапевтического применения. Они позволяют расширить методики лечения.
Вам будет интересно: Глаголы говорения в русском языке: общая характеристика, примеры
рекомбинантные белки, полученные с помощью генной инженерии, играют ключевую роль на рынке терапевтических лекарств. В настоящее время больше всего терапевтических веществ продуцируется в клетках млекопитающих, поскольку их составы способны производить высококачественные вещества, подобные природным. Кроме того, многие одобренные рекомбинантные терапевтические белки вырабатываются в кишечной палочке благодаря хорошей генетике, быстрому росту и высокопродуктивному производству. Это также несет положительный эффект при разработке лекарственных средств на основе этого вещества.
Проведение исследований
Получение рекомбинантных белков строится на разных методах. Вещества помогают выяснить основные и фундаментальные принципы организма. Эти молекулы могут быть использованы для идентификации и определения местоположения вещества, кодируемого конкретным геном, и для раскрытия функции других генов в различных клеточных активностях, таких как передача сигналов клетками, метаболизм, рост, репликация и гибель, транскрипция, трансляция и модификация рассматриваемых в статье составов.
Таким образом, обозреваемый состав часто используются в молекулярной биологии, клеточной биологии, биохимии, структурных и биофизических исследованиях и многих других областях науки. При этом получение рекомбинантных белков имеет международную практику.
Вам будет интересно: Дисклеймер – это попытка уйти от ответственности
Такие составы являются полезными инструментами в понимании межклеточных взаимодействий. Они доказали свою эффективность в нескольких лабораторных методах, таких как ИФА и иммуногистохимия (IHC). Рекомбинантные белки могут быть использованы для разработки ферментных анализов. При использовании в сочетании с парой соответствующих антител клетки могут применяться в качестве стандартов, для применения новых технологий.
Биотехнологии
Рекомбинантные белки, содержащие аминокислотную последовательность, также используются в промышленности, производстве продуктов питания, сельском хозяйстве и биоинженерии. Например, в животноводстве ферменты могут добавляться в пищу, чтобы повысить питательную ценность кормовых ингредиентов, снизить затраты и отходы, поддержать здоровье кишечника животных, улучшить производительность и улучшить окружающую среду.
Кроме того, молочнокислые бактерии (ЛАБ) долгое время использовались для производства ферментированных пищевых продуктов, и недавно ЛАБ была разработана для экспрессии рекомбинантных белков содержащих аминокислотную последовательность, которые могут найти широкое применение, например, для улучшения пищеварения человека, животных и питания.
Однако такие вещества также имеют ограничения:
В целом, достижения в области биотехнологии увеличили и способствовали производству рекомбинантных белков для различных применений. Хотя они все еще имеют некоторые недостатки, вещества важны в медицине, исследованиях и биотехнологии.
Связь с болезнями
рекомбинантный белок вред для человека не несет никакой. Это лишь составная часть общей молекулы при разработке конкретного препарата или элемента питания. Многие медицинские исследования показали, что принудительная экспрессия белка FGFBP3 (сокращенно BP3) в лабораторном штамме мышей с ожирением показала значительное снижение их жировой массы, несмотря на генетическую предрасположенность к употреблению.
Результаты таких опытов показывают, что белок FGFBP3 может предложить новую терапию для устранения нарушений, связанных с метаболическим синдромом, таких как диабет 2 типа и ожирение печени. Но поскольку BP3 является природным белком, а не искусственным лекарственным средством, клинические испытания рекомбинантного человеческого BP3 могут начаться после заключительного раунда доклинических исследований. На, то есть причины связанные с безопасностью проведения таких исследований. Рекомбинантный белок вред для человека не несет и по причине его ступенчатой обработки и очистки. Изменения происходят и на молекулярном уровне.
В экспериментах с проверкой концепции исследователи из Университета Алабамы в Бирмингеме под руководством доктора медицинских наук Х.Лонг Чжэна, профессора Роберта Б. Адамса и директора отдела лабораторной медицины на кафедре патологии в школе UAB Медицины, выдвинули на первый план потенциальную терапию редкого, но смертельного нарушения свертываемости крови, TTP.
Результаты этого исследования впервые демонстрируют, что переливание тромбоцитов, нагруженных rADAMTS13, может быть новым и потенциально эффективным терапевтическим подходом к тромбозу артерий, связанному с врожденным и иммуноопосредованным TTP.
Рекомбинантный белок — это не только питательное вещество, но и лекарственное средство в составе разрабатываемого препарата. Это лишь не многие направления, которые сейчас задействуются в медицине и относящиеся к исследованию всех его структурных элементов. Как показывает международная практика, структура вещества дает возможность на молекулярном уровне бороться со многими серьезными проблемами в организме человека.
Разработка вакцин
Рекомбинантный белок — это определенный набор молекул, которые можно моделировать. Подобное свойство используется и при разработке вакцин. Новая стратегия вакцинации, также известная как использование специальной рекомбинантной вирусной инъекции, может обеспечить защиту миллионов цыплят, которым угрожает серьезное респираторное заболевание, сообщили исследователи из Университета Эдинбурга и Института Пирбрайта. Эти вакцины используют безвредные или слабые версии вируса или бактерии для введения микробов в клетки организма. В этом случае эксперты использовали рекомбинантные вирусы с разными белками спайков в качестве вакцин для создания двух версий безвредного вируса. Существует много различных лекарственных препаратов построенных на это связи.
Рекомбинантный белок торговые названия и аналоги имеет следующие:
В основном это противоопухолевые препараты, но есть и другие направления в лечении, связанные с этим активным веществом.
Согласно новому исследованию, опубликованному в научном журнале Nature Communications, новая вакцина, также называемая LASSARAB, предназначенная для защиты людей как от лихорадки Ласса, так и от бешенства, показала многообещающие результаты в доклинических исследованиях. Кандидат на инактивированную рекомбинантную вакцину использует ослабленный вирус бешенства.
Исследовательская группа вставила генетический материал вируса Ласса в вектор вируса бешенства, чтобы вакцина экспрессировала поверхностные белки как у Ласса, так и клеток бешенства. Эти поверхностные составы вызывают иммунный ответ против возбудителей инфекций. Затем такая вакцина была инактивирована для «уничтожения» живого вируса бешенства, использованного для изготовления носителя.
Методы получения
Есть несколько систем производства вещества. Общий метод получения рекомбинантного белка строится на получении из синтеза биологического материала. Но есть и другие способы.
В настоящее время существует пять основных систем экспрессии:
Последний вариант особенно подходит для экспрессии трансмембранных белков и токсичных составов. В последние годы вещества, которые трудно экспрессировать обычными внутриклеточными способами, успешно интегрируются в клетках in vitro. В Беларуси получение рекомбинантных белков получило широкое применение. Есть ряд государственных предприятий, занимающихся этим вопросом.
Бесклеточная технология может легко и контролируемо добавлять разнообразные не встречающиеся в природе аминокислоты для достижения сложных процессов модификации, которые трудно решить после обычной рекомбинантной экспрессии. Подобные методы имеют высокую ценность для применения и потенциал для доставки лекарств и разработки вакцин с использованием вирусоподобных частиц. Большое количество мембранных белков было успешно экспрессировано в свободных клетках.
Экспрессия составов
Рекомбинантный белок CFP10-ESAT 6 вырабатывается и применяется для создания вакцин. Такой туберкулезный аллерген позволяет усилить иммунитет и выработать антитела. В общем, молекулярные исследования включают изучение любого аспекта белка, такого как структура, функция, модификации, локализация или взаимодействия. Чтобы исследовать, как конкретные вещества регулируют внутренние процессы, исследователям обычно требуются средства для производства функциональных соединений, представляющих интерес и пользу.
Учитывая размер и сложность белков, химический синтез не является жизнеспособным вариантом для этого начинания. Вместо этого, живые клетки и их клеточные механизмы обычно используются как фабрики для создания и конструирования веществ на основе предоставленных генетических шаблонов. Система экспрессии рекомбинантных белков в дальнейшем вырабатывает необходимую структуру для создания лекарства. Далее происходит отбор необходимого материала для разной категории препаратов.
В отличие от белков, ДНК легко конструировать синтетически или in vitro, используя хорошо зарекомендовавшие себя методы рекомбинантной. Следовательно, ДНК-матрицы специфических генов, с добавленными репортерными последовательностями или последовательностями аффинных меток или без них, могут быть сконструированы в качестве матриц для экспрессии обозреваемого вещества. Такие составы, полученные из таких ДНК-матриц, и называются рекомбинантными белками.
Традиционные стратегии экспрессии вещества включают трансфекцию клеток с помощью ДНК-вектора, который содержит матрицу, и последующее культивирование клеток с тем, чтобы они транскрибировали и транслировали желаемый белок. Обычно клетки затем лизируют для экстракции экспрессированного состава для последующей очистки. Белок рекомбинантный CFP10-ESAT6 обрабатывается таким образом и проходит систему очистки от возможного образования токсинов. Только после этого он поступает для синтезирования в вакцину.
Как прокариотические, так и эукариотические in vivo системы экспрессии молекулярных веществ широко используются. Выбор системы зависит от типа белка, требований к функциональной активности и желаемого выхода. Эти системы экспрессии включают млекопитающих, насекомых, дрожжей, бактерий, водорослей и клеток. У каждой системы есть свои преимущества и проблемы, и выбор правильной системы для конкретного применения важен для успешной экспрессии обозреваемого в статье вещества.
Экспрессия из млекопитающих
Вам будет интересно: Расстояние от Краснодара до Сочи. Особенности поездки по маршруту
Применение рекомбинантных белков позволяет разрабатывать вакцины и лекарства разного уровня. Для этого может задействоваться этот метод получения вещества. Системы экспрессии млекопитающих могут быть использованы для продуцирования белков из животного мира, которые имеют наиболее нативную структуру и активность благодаря своей физиологически релевантной среде. Это приводит к высоким уровням посттрансляционной обработки и функциональной активности. Системы экспрессии млекопитающих могут использоваться для производства антител, сложных белков и соединений для использования в функциональных анализах на основе клеток. Тем не менее, эти преимущества в сочетании с более жесткими условиями культуры.
Системы экспрессии млекопитающих можно использовать для получения белков временно или через стабильные клеточные линии, где конструкция экспрессии интегрирована в геном хозяина. В то время как такие системы могут использоваться в нескольких экспериментах, временная продукция может генерировать большое количество вещества за одну-две недели. Биотехнология рекомбинантных белков такого типа пользуется высоким спросом.
Эти преходящие, высокопродуктивные системы экспрессии млекопитающих используют суспензионные культуры и могут давать выход грамм на литр. Кроме того, эти белки имеют больше нативного фолдинга и посттрансляционных модификаций, таких как гликозилирование, по сравнению с другими системами экспрессии.
Экспрессия из насекомого
Методы получения рекомбинантного белка не ограничиваются только млекопитающими. Есть и более продуктивные способы в плане стоимости производства, хоть и выхода вещества на 1 литр обрабатываемой жидкости значительно ниже.
Клетки насекомых можно использовать для экспрессии белка высокого уровня с модификациями, подобными системам млекопитающих. Существует несколько систем, которые можно использовать для получения рекомбинантного бакуловируса, который затем можно применять для извлечения, представляющего интерес вещества в клетках насекомых.
Экспрессии рекомбинантных белков могут быть легко расширены и адаптированы к суспензионной культуре высокой плотности для крупномасштабного получения соединения молекул. Они более функционально похожи на нативный состав вещества млекопитающих. Хотя выход может составлять до 500 мг / л, производство рекомбинантного бакуловируса может занимать много времени и условия культивирования более сложные, чем прокариотические системы. Однако в более южных и теплых странах подобный метод считается более эффективным.
Бактериальная экспрессия
Производство рекомбинантных белков может быть налажено и при помощи бактерий. Эта технология намного отличается от описанных выше. Системы экспрессии бактериального белка популярны, потому что бактерии легко культивируются, быстро растут и дают высокие выходы рекомбинантного состава. Тем не менее, мультидоменные эукариотические вещества, экспрессируемые в бактериях, часто являются нефункциональными, потому что клетки не оборудованы для выполнения необходимых посттрансляционных модификаций или молекулярного сворачивания.
Кроме того, многие белки становятся нерастворимыми в виде молекул включения, которые очень трудно восстановить без жестких денатураторов и последующих громоздких процедур рефолдинга молекулярного состава. Такой метод по большей части считается еще во многом экспериментальным.
Бесклеточная экспрессия
Рекомбинантный белок содержащий аминокислотную последовательность стафилокиназы получается несколько иным путем. Он входит в состав многих видов инъекций, от чего требуется несколько систем перед использованием.
Бесклеточная экспрессия белка представляет собой синтез вещества in vitro с использованием совместимых с трансляцией экстрактов целых клеток. В принципе, целые клеточные экстракты содержат все макромолекулы и компоненты, необходимые для транскрипции, трансляции и даже посттрансляционной модификации.
Эти компоненты включают РНК-полимеразу, регуляторные белковые факторы, формы транскрипции, рибосомы и тРНК. При добавлении кофакторов, нуклеотидов и специфической матрицы генов эти экстракты могут синтезировать представляющие интерес белки за несколько часов.
Хотя они не являются устойчивыми для крупномасштабного производства, бесклеточные системы или системы экспрессии белка in vitro (IVT) имеют ряд преимуществ по сравнению с традиционными системами in vivo.
Бесклеточная экспрессия позволяет быстро синтезировать рекомбинантные составы без задействования клеточной культуры. Бесклеточные системы позволяют метить белки модифицированными аминокислотами, а также экспрессировать составы, которые подвергаются быстрой протеолитической деградации внутриклеточными протеазами. Кроме того, с помощью бесклеточного метода проще одновременно экспрессировать много разных белков (например, тестировать мутации белка путем экспрессии в небольшом масштабе из множества различных матриц рекомбинантных ДНК). В этом репрезентативном эксперименте для экспрессии белка каспазы-3 человека использовали систему IVT.
Выводы и перспективы на будущее
Производство рекомбинантного белка теперь можно рассматривать как зрелую дисциплину. Это результат многочисленных постепенных улучшений в очистке и анализе. В настоящее время программы по открытию лекарств редко останавливаются из-за невозможности продуцировать целевой белок. Параллельные процессы для экспрессии, очистки и анализа нескольких рекомбинантных веществ в настоящее время хорошо известны во многих лабораториях по всему миру.
Белковые комплексы и растущий успех в создании солюбилизированных мембранных структур потребуют большего количества изменений, чтобы идти в ногу со спросом. Появление эффективных контрактных исследовательских организаций для более регулярного снабжения белками позволит перераспределить ресурсы науки для решения этих новых задач.
Дополнительно, параллельные рабочие процессы должны позволять создавать полные библиотеки обозреваемого вещества, чтобы обеспечить возможность идентификации новых целей и расширенного скрининга, наряду с традиционными проектами по обнаружению лекарств на основе малых молекул.