Временные препараты для светового микроскопа в отличие от постоянных можно сделать сравнительно быстро. Они пригодны для проведения быстрых предварительных исследований. Материал для этого фиксируют, окрашивают и заключают в ту или иную среду. Срезы можно приготовить до фиксации или мацерации (древесину, например, мацерируют). Срез свежего материала можно сделать вручную с помощью бритвы непосредственно в 70%-ном этаноле, который служит фиксатором. Для окрашивания и заключения можно использовать ряд временных красителей; некоторые из них, пригодные для окрашивания растительного материала, приведены в табл. 5.5. Каждый срез следует поместить на чистое предметное стекло (предварительно протертое спиртом) и капнуть на него несколько капель красителя. При окрашивании флороглюцинолом добавляют также одну каплю концентрированной соляной кислоты. Затем препарат накрывают тонким покровным стеклом, чтобы предотвратить попадание воздуха и пыли и предохранить от загрязнения объектив большого увеличения. Если образец начнет подсыхать или если заранее известно, что потребуется длительное изучение (более 10 мин), то после окрашивания препарат следует заключить в глицерол.
Рисунки в биологии
Цель рисунков в биологии 1. Документировать результаты работы для использования в дальнейшем. 2. Дополнить визуальное наблюдение и дать возможность рассмотреть исследуемый объект более полно и точно. 3. Способствовать запоминанию, зарисовывая то, что вы видите.
Правила рисунков в биологии
1. Необходимо использовать бумагу для рисования соответствующей толщины и качества. С нее должны хорошо стираться карандашные линии.
2. Карандаши должны быть острыми, твердости НВ, не цветными.
3. Рисунок должен быть: а) достаточно крупным — чем больше элементов составляют исследуемый объект, тем крупнее должен быть рисунок; он должен, как правило, занимать более половины листа; б) тщательно выполненным — должны соблюдаться соотношения различных частей объекта. Если объект имеет несколько сходных частей, необходимо точно вырисовывать их мелкие детали; в) нарисован тонкими и отчетливыми линиями — каждую линию необходимо продумать и затем нарисовать без отрыва карандаша от бумаги; не штриховать и не раскрашивать; г) надписи должны быть по возможности полными, идущие от них линии не должны пересекаться; оставляйте вокруг рисунка место для надписей (желательно располагать их вертикально). К надписям могут быть сделаны примечания по поводу, например, интенсивности или оттенка окраски, усыхания ткани, каких-либо необычных или, наоборот, характерных особенностей образца.
4. При необходимости следует делать два рисунка: а) схематичный рисунок, показывающий основные черты, и б) только детали мелких частей. Например, при малом увеличении нарисовать план поперечного сечения растения, на котором будут видны только различные ткани, но не отдельные клетки, и при большом увеличении — детальное строение клеток (крупно нарисованную часть рисунка обводят на плане клином или квадратом).
5. Рисовать следует только то, что вы действительно видите, а не то, что вам кажется вы должны видеть, и, конечно же, не копировать рисунок из книги.
6. Каждый рисунок должен иметь название, указание об увеличении и о проекции образца (например, ПС, ПрС и т. д.) и объяснительную записку. Все это следует помещать в определенном месте, например в правом верхнем углу страницы. Если возможно, должен быть указан также масштаб.
7. Идущие от надписей линии (их следует проводить по линейке) должны заканчиваться точно у той структуры, к которой относится надпись, причем надписями должны быть снабжены все структуры, которые могут представлять интерес.
Далеко не всё, что есть под рукой, имеет смысл класть на предметный столик и пытаться рассмотреть в окуляр микроскопа. Например, непрозрачные объекты (палец, монета) рассмотреть совсем не удастся, да и для рассматривания вполне достаточно сильной лупы.
Обычно для микроскопирования используют специально приготовленные микропрепараты. При приготовлении микропрепарата берется предметное стекло (размер 25 × 75 мм), на которое помещается рассматриваемый объект; обычно для лучшей сохранности и удобства использования объект накрывается сверху тонким покровным стеклом (размер 18 × 18 мм).
По способу приготовления и времени хранения различают:
В таблице представлены типы препаратов в зависимости от характера исследуемого объекта.
Описание
Постоянный/ временный
Пример
Целый организм или его небольшие части (конечности, ротовой аппарат). Обычно требуют обработки (осветления)
Объект заливается в пластичный материал (парафин, акрил) и после его затвердевания разрезается на тонкие пластины с помощью микротома (приспособления для получения тонких срезов)
Токослойный препарат без покровного стекла (обычно препарат крови): капля с помощью полированного стекла размазывается по поверхности предметного стекла тонким слоем, высушивается
Временный, реже постоянный
Тонкая (толщина 0,03-0,02 мм) пластинка горной породы или другого твердого образца (кости, окаменелости), приклеенная к покровному стеклу
В некоторых случаях временный препарат можно рассматривать непосредственно, не накрывая покровным стеклом. Такой препарат будет практически невозможно рассмотреть резко сразу весь – какая-то часть его будет в фокусе, а остальное – нет. Но если рассматривать такой препарат с малым увеличением микроскопа, можно рассмотреть некоторые интересные объекты.
Микропрепарат клеток мякоти арбуза (без покровного стекла)
Так же в виде открытых временных препаратов можно вырастить кристаллы разных солей (ацетилсалициловой кислоты, или аспирина; медного купороса, или сульфата меди; красной кровяной соли, или гексацианоферрата калия). На предварительно очищенное от пыли и отпечатков пальцев наносится несколько капель водного или спиртового раствора соли (для лучшего качества кристаллов раствор предварительно лучше профильтровать, так как это позволит уменьшить количество точек кристаллизации и получить более крупные и аккуратные кристаллы). Каплям дают высохнуть (можно провести эксперимент с одним из стекол, нагрев его, с целью ускорения выпаривания, а другому дать растворителю испариться, а кристаллам – выпасть самостоятельно). Также можно рассматривать полуготовый микропрепарат на этапе процесса кристаллизации: можно увидеть, как кристалл увеличивается прямо на глазах или как вокруг зародыша твердого вещества возникает течение жидкости из-за разницы концентраций ионов.
Простой и эффектный способ изготовления микропрепаратов без срезов, позволяющий рассмотреть рельеф поверхности изучаемого объекта (например, листа растения, покровов тела насекомого) – метод реплик. При этом берется объект (например, лист растения), и на него наносится тонкий слой прозрачного лака для ногтей (достаточно небольшого пятна 5 × 10 мм). После того, как лак высохнет (примерно через 5-7 минут), к лаковому пятну приклеивается кусок липкой ленты; так реплика отделяется, после чего ее кладут на предметное стекло и рассматривают под микроскопом.
Реплика поверхности листа, видны устьичные клетки и жилка (микроскоп Микромед С-13, малое увеличение).
1.1. Приготовление временного препарата
Техника приготовления временного препарата хорошо известна по школьным опытам с кожицей лука. Кладем предметное стекло на стол (препараты всегда держат за боковые грани предметного стекла). В центр стекла помещаем 1-2 капли воды и объект исследования Берем покровное стекло за боковые грани и осторожно накрываем им сверху каплю с объектом. Правильнее упереть покровное стекло одной из граней в предметное и медленно уменьшать угол между стеклами так, чтобы накрыть каплю с объектом. Это уменьшает возможность появления пузырьков воздуха.
Накрывание объекта покровным стеклом
1.2. Приготовление мазка крови
Мазки крови для исследования крови готовят следующим образом.
Описание
Фотография
Поместите небольшую каплю крови на лежащее на горизонтальной поверхности предметное стекло, с помощью стеклянной капиллярной пипетки (или непосредственно из места укола пальца перенесите выступившую каплю крови на конец стерильного предметного стекла, стараясь не касаться стекла проколотым участком кожи).
Чистое шлифованное стекло помещается коротким ребром под углом 45° к предметному стеклу у края капли. Ждем, пока кровь расплывется под ребром стекла.
Как только кровь растеклась по ребру, быстрым движением от капли проводим по предметному стеклу. Не следует сильно нажимать на стекло, так как при этом могут разрушиться форменные элементы крови.
После приготовления мазок быстро сушат на воздухе до исчезновения влажного блеска, подержав его над абажуром лампы или помахав им в воздухе. Хорошо сделанный мазок тонок, имеет желтоватый цвет и оканчивается «метелочкой». Густо-розовые и красноватые мазки непригодны, так как они слишком толстые и клеточные элементы различить будет сложно.
2. Некоторые особенности микроскопирования
Использование микроскопов на малом и большом увеличении достаточно хорошо известно по школьным опытам и не требует особо сложных навыков.
2.1. Имерсионный объектив
Если в ващем распоряжении имеется микроскоп с иммерсионным объективом (он маркируется 100× МИ и черным кольцом, и имеет подвижную часть объектива, обращаемую к микропрепарату), то у вас есть возможность рассмотреть объекты с большим увеличением (однако для этого имеет смысл использовать мазки).
При работе с иммерсионным объективом потребуется максимальная освещенность. После окончания исследования иммерсионный объектив нужно протереть мягкой оптической тряпочкой или батистовой, слегка смоченной специальной жидкостью для чистки оптики. Важно: любые другие виды объективов протирать нельзя!
Применение вместо кедрового масла других масляных жидкостей не рекомендуется, т. к., если показатель преломления используемой иммерсии (например, вазелинового масла с показателем 1,48162) отличается от показателя преломления кедрового масла (показатель 1,515), возможно снижение контраста, нечеткость изображения, уменьшение разрешающей способности.
2.2. Фотографии в косом освещении и темном поле
Для объемных препаратов (тотальные препараты насекомых, водорослей и др.) интересно использовать освещение, отличное от обычного просвечивающего. Для регулировки освещения в микроскопах используется конденсор – поворотное устройство с отверстиями разного диаметра и расположения. Используя специальные варианты конденсора, можно изменить характер освещения препарата, подчеркнув объем рассматриваемого объекта.
В таблице сравнивается работа с освещением разных типов.
Тип освещения
Способ создания
Вид зрачка объектива с вынутым окуляром
Пример
Свет проходит через поле зрения равномерно.
Свет проходит через препарат под углом, так как конденсор закрывает часть отверстия. Этого эффекта можно добиться притеняя рукой или другой преградой часть светового потока перед зеркалом микроскопа
Специальный конденсор закрывает центральную часть поля зрения, так что свет проходит с краев. При определенной тренировке такого эффекта также можно добиться, частично притеняя часть светового потока перед зеркалом микроскопа
3. Съемка
Фотографирование настроенного на резкость микропрепарата с помощью камеры планшета особых трудностей не представляет, так как мы непосредственно контролируем то, что именно будем снимать. Настройки камеры планшета также зависят от типа устройства, которое вы используете; так как камера планшета обычно имеет достаточно большую глубину резкости, даже при настройках камеры по умолчанию можно получить вполне качественное изображение.
Планшетный компьютер и микроскоп: съемка, фотография, кадр с выносками и обозначениями
4. Интернет-ресурсы
Лекция по микроскопированию для студентов:
Простые опыты в домашних экспериментах:
Сайты с историческими микроскопами и микропрепаратами:
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ
ДАГЕСТАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
Предметом изучения цитологии, гистологии и эмбриологии являются клеточно-тканевые структуры организмов на микроскопическом уровне, а предметом изучения – микроскопический препарат. Поэтому для успешного освоения этих наук необходимо владеть гистологической техникой – приемами и методами изготовления микроскопических препаратов и способами их изучения. В настоящем руководстве изложены основные сведения по технике гистологических исследований, оно знакомит студентов с правилами работы и методами наблюдения под микроскопом, методикой приготовления препаратов. Особое внимание уделено методам окрашивания различных клеточно-тканевых структур и гистохимическим исследованиям. Методики применимы на растительных и животных объектах.
Методические указания рекомендованы для студентов, специализирующихся по кафедре физиологии человека и животных, могут быть использованы на лабораторных занятиях по цитологии, гистологии и эмбриологии, большом практикуме, при выполнении курсовых и дипломных работ.
Автор: Газимагомедова И.К. – доц. каф. зоологии и физиологии, канд. биол. наук
Приготовление постоянного микротомного препарата Взятие и фиксация материала …………………………….
Уплотнение (заливка в парафин) ………………………….
Окрашивание и заключение в бальзам ………………….
Методы окрашивания гистологических препаратов …
Методы окраски клеток и неклеточных структур соединительной ткани ……………………………………..
Выявление элементов нервной системы
Приготовления препаратов давленных объектов. Методы изучения митоза и мейоза ………………………
1. Световая Микроскопия
1.1. Устройство микроскопа
В микроскопе различают оптическую (объектив, окуляр), осветительную (источник света, зеркало, конденсор и диафрагма) и механическую (штатив, предметный столик, колонка с макро- и микровинтами, тубус) части (рис. 1).
Рис.1. Световой микроскоп.
Полное увеличение микроскопа оценивают как произведение увеличений объектива и окуляра, например, при объективе 20 и окуляре 10 полное увеличение микроскопа будет 200 (20 10 = 200 раз).
Разрешающая способность объектива, т.е. минимальное расстояние между двумя видимыми точками (минимальный размер объекта):
где: λ – длина волны света, используемого для освещения объекта; n – коэффициент преломления среды (воздух или масло); α – угол между оптической осью объектива и наиболее отклоняющимся лучом, попадающим в объектив (максимально 90°); n ∙ sin α – апертура линз.
Если использовать ультрафиолетовый свет (260 – 280 нм), то можно повысить разрешение до 130-140 нм (0,13 – 0,14 мкм). Это будет пределом теоретического разрешения светового микроскопа, определяемым волновой природой света. Таким образом, все, что может дать световой микроскоп как вспомогательный прибор к нашему глазу – это повысить разрешающую способность его примерно в 1000 – 2500 раз. Это и есть “полезное” увеличение микроскопа, выше которого мы будем только увеличивать контуры изображения, не открывая в нем новых деталей. Следовательно, при использовании видимой области света 0,2–0,3 мкм является конечным пределом разрешения светового микроскопа (минимальное расстояние на котором различимы два объекта).
Зеркало собирает лучи от источника света и направляет их на препарат снизу. При искусственном освещении используется вогнутая поверхность зеркала, а при дневном – плоская.
Конденсор состоит из линз, которые фокусируют лучи света на препарате. Поднимая и опуская конденсор (с помощью винта), можно настраивать фокусировку лучей. При подъеме конденсора попадающие на препарат лучи рассеиваются, при опускании концентрируются на препарате, но на более ограниченном участке. Обычно работают при конденсоре, поднятом до уровня столика.
В итоге, световые лучи проходят следующий путь: источник света → зеркало → конденсор → диафрагма → препарат → объектив → тубус → окуляр. Т.е. микроскопия ведётся в проходящем свете, для чего препарат должен быть достаточно тонким.
1.2. Техника микроскопирования
Изучить препарат при малом увеличении.
Перевести препарат на большое увеличение. Для этого сменяют объектив на 40 поворотом для револьвера. Медленно и осторожно опускают тубус почти до касания объективом покровного стекла (до образования узкой щели), чтобы не раздавить стекла. Медленно вращая микровинт на пол-оборота вперед или назад, достигается четкость изображения. На микровинт бывает надето кольцо с делениями, показывающими, на сколько микрон мы поднимаем или опускаем тубус. На левом барабанчике этого винта нанесено 50 делений, и каждое перемещение на одно деление соответствует 2 микронам. Эти деления также позволяют оценить толщину препарата и определить, на какой относительной глубине залегают те или иные структуры в срезе, например, каков слой цитоплазмы над или под ядром, каков размер последнего.
Для изучения очень мелких структур используют иммерсионный объектив ( 90). При этом на покровное стекло препарата наносят каплю иммерсионной среды (бывают масляные, водные, глицериновые), обычно кедровое масло, затем осторожно опускают тубус до соприкосновения линзы объектива с маслом. Четкость изображения регулируют микровинтом. После работы удаляют марлей иммерсионное масло с объектива и покровного стекла.
2. Приготовление постоянного микротомного препарата
Приготовление постоянных гистологических препаратов включает следующие этапы: 1) взятие и фиксация материала; 2) промывка и обезвоживание; 3) уплотнение (заливка в парафин); 4) приготовление срезов; 5) окрашивание; 6) обезвоживание и заключение препаратов в консервирующую среду (рис. 2).
2.1. Взятие и фиксация материала
Необходимое условие при взятии материала – сохранение прижизненной организации тканей. Для этого материал берут «живьем» и быстро убивают, обычно погружая в специальные фиксирующие жидкости, в целях сохранения витальной структуры, т.е. проводят фиксацию.
Рис. 2. Этапы приготовления гистологического препарата для световой микроскопии.
В зависимости от строения органа взятие материала осуществляется по-разному. Из однородных органов (печень, селезенка) кусочек можно вырезать из любого участка. Из неоднородных органов (почка, надпочечник) необходимо так вырезать кусочек, чтобы попали все слои. Величина кусочка зависит от структуры органа, целей исследования и способов дальнейшей обработки. Из соответствующего органа вырезают обычно небольшие кусочки (0,5 x 1 x 1 см ).
Способы фиксации – использование фиксирующих жидкостей, криофиксация (мгновенное замораживание в жидком азоте) и лиофилизация (замораживание с последующим высушиванием в вакууме). При лиофилизации выпадает необходимость проводить обезвоживание и уплотнение материала.
Фиксирующие средства бывают простые и сложные. К первым относятся спирты, ацетон, кислоты, формалин, сулема, пикриновая кислота, тетраоксид осмия. Сложными являются смеси различных веществ, например жидкость Ценкера, жидкость Карнуа, жидкость Буэна и т.д. Так, для лучшей фиксации ядер употребляют хромовые или хромосмиевые смеси, для фиксации цитоплазмы смеси Карнуа или Буэна. Фиксирующие свойства зависят от рН среды, температуры, продолжительности фиксации.
В последнее время, особенно для электронной микроскопии, широко используется глютаровый альдегид, который более эффективно сшивает молекулы и тем самым обладает сильным фиксирующим действием.
Требования, предъявляемые к фиксатору : 1) свежесть; 2) достаточное количество. Объем фиксатора должен в 20-40 раз превышать объем фиксируемого материала, объект со всех сторон должен быть окружен фиксатором. Если часть материала плавает на поверхности фиксатора, то сверху накладывают тонкий слой ваты. Как до, так и после фиксации объект не должен подсыхать на воздухе.
100% или 96% спирт……………………6 частей
Ледяная уксусная кислота…………… 1 часть
Фиксатор готовят перед употреблением. Фиксируют от 30 мин до 3 ч, затем кусочки можно хранить в 70% спирте.
100% или 96% этиловый спирт………. 3 части
Продолжительность фиксации – 2-12 ч. Иногда в нем хранят материал при 0-3 о С.
Двухромовокислый калий………………2,5 г
Сернокислый натрий…………………….1 г
Дистиллированная вода…………………100 мл
Ледяная уксусная кислота………………5 мл (добавляют перед употреблением)
Фиксируют 1-24 ч. Затем 24 ч промывают в водопроводной воде до обесцвечивания воды. Материал обесцвечивают в 70% спирте, где его можно хранить. Цвет фиксатора – насыщенно красно-бордовый. Как только сулема будет удалена, раствор перестанет обесцвечиваться.
100% или 96% спирт…………………….10 мл
Ледяная уксусная кислота………………2 мл
Фиксируют от 5 мин и более. Фиксатор пригоден для приготовления временных давленых препаратов.
5% формалин: 1 часть 40% формалина + 7 частей дистиллированной воды.
10% формалин: 1 часть 40% формалина + 3 части дистиллированной воды.
20% формалин: 1 часть 40% формалина + 1 часть дистиллированной воды.
Методика проведения фиксации. Берется чистая стеклянная посуда (пробирки, бюксы или стаканчики) с фиксатором, объем которого в 20-40 раз больше объема материала. На дно посуды кладут гигроскопическую или стеклянную вату для равномерного пропитывания объекта. Материал с помощью пинцета быстро помещается в фиксирующую смесь (фиксатор должен быстро проникать в ткани и не вызывать грубых нарушений тканевых структур) и посуда плотно закрывается. Вместе с материал в пробирку кладется фиксационная этикетка, сделанная из плотной бумаги, размером 1х1 см, на которой простым карандашом отмечаются название изучаемого материала, фиксатора и дата фиксации.
Если ткань богата водой или кровью, фиксатор следует дважды сменить.
После фиксации образцы промывают проточной водой (в некоторых случаях спиртом) от 1 до 3 ч, иногда дольше. Промывкой материала удаляется излишнее количество фиксатора. В зависимости от способа фиксации существуют разные способы промывки. После фиксации в смеси с пикриновой кислотой промывка производится 70-80% спиртом. При фиксации в смесях, содержащих сулему, трихлоруксусную кислоту, используют 90-96% спирт. При формалиновой фиксации и фиксации хромовыми смесями промывку производят проточной водой под краном, или неоднократной сменой воды (10-12 раз) в течение 24-48 ч. Материал, фиксированный в смесях с преобладанием спирта (фиксатор Карнуа) промывке не подвергается.
Существуют разные приспособления для промывки: 1) обычные стеклянные склянки с пробкой или завязанные марлей и резиновым шлангом, соединенные с краном; 2) для мелких объектов применяются специальные фарфоровые сита; 3) стеклянные трубочки, обвязанные с обеих сторон марлей.
Удобно провести промывку материала следующим образом: материал вместе с этикеткой переносят в марлевые узелки, перевязывают их ниткой и помещают в высокий стакан с водой. Сверху в стакан кладут воронку и все ставят под кран с проточной водой.
Далее необходимо получить срезы материала для их последующего окрашивания. Для этого образцы уплотняют, т.е. заливают в парафин или целлоидин, чтобы в последующем их можно было тонко резать. Предварительно образцы обезвоживают, чтобы гидрофобный уплотнитель смог проникнуть в ткань. Обезвоживание производится проведением материала по батарее спиртов возрастающей концентрации, что позволяет избежать разрывов и деформаций ткани.
Методика обезвоживания. Материал вынимают из марлевых узелков и вместе с этикеткой последовательно помещают в стаканчики или бюксы со спиртами (метанол или этанол) возрастающей концентрации – 70%, 80%, 96%, 100%. Чем нежнее материал, тем ниже первоначальная концентрация спирта (начинают с 20% спирта). Время выдерживания в каждом спирте зависит от толщины материала и строения органа: от 30 мин, 1-6 ч, и до 6-12 ч. В 96% и 100% спиртах выдерживают дважды. При перекладывании материала из слабого раствора спирта в спирт большей концентрации кусочки необходимо обсушить фильтровальной бумагой.
Схема и сроки выдерживания в спиртах растительного материала:
20 и окуляре 
40 поворотом для револьвера. Медленно и осторожно опускают тубус почти до касания объективом покровного стекла (до образования узкой щели), чтобы не раздавить стекла. Медленно вращая микровинт на пол-оборота вперед или назад, достигается четкость изображения. На микровинт бывает надето кольцо с делениями, показывающими, на сколько микрон мы поднимаем или опускаем тубус. На левом барабанчике этого винта нанесено 50 делений, и каждое перемещение на одно деление соответствует 2 микронам. Эти деления также позволяют оценить толщину препарата и определить, на какой относительной глубине залегают те или иные структуры в срезе, например, каков слой цитоплазмы над или под ядром, каков размер последнего.