Диализ белков: концентрирование и обессоливание. Обзор
Диализ — процесс разделения молекул в растворе по разности их скоростей диффузии через полупроницаемую мембрану. После многократной замены внешнего раствора состав среды по обеим сторонам от мембраны (концентрация солей, pH) будет тот же, что и в окружающем растворе.
Это распространенный метод, который применяется для удаления нежелательных небольших молекул (солей, красителей и др.), из более крупных макромолекул (белков, ДНК, полисахаридов).
Диализ используется для обессоливания, удаления меченых реагентов, низкомолекулярных примесей, исследования связывания активной фармсубстанции, изучения клеток, очистки вирусов, обработки крови.
Продукция Thermo FS для диализа даёт возможность работать с образцами в широком диапазоне объёмов от 10 мкл до 250 мл. Специальные диализные ёмкости не требуют применения клипс и других дополнительных приспособлений, что позволяет сэкономить время, избегать потерь или загрязнений образца и процесс простым.
Продукты снабжены MWCO-мембраной (Molecular Weight Cut-Off), предназначенной для диализа молекул с молекулярным весом до 2; 3,5; 7; 10 или 20 кДа.
Выбор подходящего продукта определяется, в большей степени, объемом и молекулярным весом (MWCO).
Наличие у типов продуктов для диализа позиций с различными MWCO-мембранами
MWCO / Тип продукта
Планшет и вставки (10-100 мкл)
Применяются для быстрой одновременной обработки нескольких образцов небольшого объема (до 96 образцов по 10-100 мкл). Диализ может быть проведен за 2-4 часа с выходом продукта более 90%.
Вставки имеют два варианта заказа по MWCO – 3.5K и 10K.
Ёмкости (10-2000 мкл)
Представляют собой полипропиленовые стаканчики со встроенной мембраной. Различаются по объему (до 2 мл) и MWCO. Вставляются в обычные центрифужные пробирки на 1,5; 15 и 50 мл (заказываются отдельно). Диализ происходит за 15 мин с выходом продукта боле 95%.
Кассеты (0,1-70 мл)
Обеспечивают простое и эффективное удаление буферных солей и мелких загрязнений образцов объемом от 0,1 мл до 30 мл (до 70 мл у кассет типа G2). После добавления образца в кассету её помещают в сосуд с буфером. Поплавок на верхней части кассеты обеспечивает плавучесть.
У кассет типа G2 конструкция позволяет загружать образец обычной пипеткой.
Колбы (150-250 мл)
Пригодны для работы с образцами объемом от 150 до 250 мл. Обеспечивают простое и эффективное удаление буферных солей и мелких загрязнений. Образцы могут быть легко добавлены и удалены пипеткой или путем прямой заливки через широкое отверстие в верхней крышке колбы. После чего колба помещается в сосуд с буфером. Поплавок на горлышке колбы обеспечивает плавучесть.
Мешки (15-100 мл)
Мешки (трубки) для диализа представляют собой трубочки из регенерированной целлюлозы. Концы фиксируются с помощью специальных зажимов (заказываются отдельно). Отличаются объёмом вмещаемого образца (до 100 мл), диаметром и MWCO. Диализ может быть проведен за 4 – 6 часов с выходом продукта более 90%.
Цветовая кодировка по MWCO
Для удобства пользователей производителем разработана специальная цветовая кодировка всех типов продуктов для диализа в зависимости от значения MWCO.
Замена буферного раствора
Замена буферного раствора — важный этап при подготовке образцов биологических проб, такая процедура выполняется для подготовки образцов перед выделением целевого компонента или перед последующим длительным хранением пробы. При использовании диализных кассет, мешков и других ёмкостей, необходимо достаточно большое количество буфера и затрат времени. Использование центрифужных концентраторов Vivaspin20 совместно с диализными вставками VSA005 (Sartorius) позволяют ускорить этот процесс с затратой меньшего количества буфера и эффективно проводить одновременно его обессоливание и концентрирование.
Одновременно с этим при концентрировании белков, склонных к преципитации при повышенном содержании солей, необходимо дольше их поддерживать в растворенном состоянии. Использование концентраторов с диализными вставками позволяет проводить постепенную градиентную замену буфера и более эффективно понижает концентрацию солей. А так как замена буфера при таком способе происходит значительно быстрее, целевые белки в большей степени защищены от действия протеаз.
Диализ удаляет из организма продукты обмена веществ и жидкости, которые ваши почки не в состоянии удалить. Целью диализа также является поддержание баланса организма путем корректировки уровней различных токсических веществ в крови. Без диализа все пациенты с неработающими почками умерли бы от скопления токсинов в организме.
Принципы диализа
Существует два типа диализа: перитонеальный диализ и гемодиализ. Какой бы вариант лечения не был выбран, цели диализа очень похожи: диализ предназначен для замены основных почечных функций. Цели терапии: удаление продуктов обмена веществ, удаление лишней жидкости и поддержание сбалансированного количества химических соединений (электролитов) и других веществ в организме. Для эффективного диализа требуется: полупроницаемая мембрана, подача крови, диализный раствор и метод удаления лишней жидкости.
Полупроницаемая мембрана
В процессе диализа полупроницаемая мембрана отделяет кровь от диализного раствора. Эта мембрана пропускает через себя только определенные вещества. Она позволяет удалить продукты обмена веществ, воду, электролиты и другие вещества из крови в диализный раствор (и иногда в другом направлении) посредством процесса, называемого диффузией. Перемещение продуктов жизнедеятельности и других веществ зависит от проницаемости мембраны, размера и структуры различных веществ, состава диализного раствора и подачи крови к мембране.
Кровоснабжение
Чем эффективнее подача крови к мембране, тем выше качество диализной терапии. При гемодиализе подача крови может контролироваться диализным аппаратом.
Диализирующий раствор
В случае применения любого из двух методов диализа диализирующий раствор обеспечивает удаление из крови продуктов обмена веществ. Кроме этого, он содержит определенные вещества, помогающие корректировать дисбаланс, являющийся результатом почечной недостаточности.
Удаление жидкости
Удаление жидкости при гемодиализе достигается путем очень разных процессов (в отличие от перитонеального диализа). При гемодиализе диализный аппарат использует разницу давлений, чтобы спровоцировать жидкость выходить из крови через мембрану в диализирующий раствор. При перитонеальном диализе в диализном растворе используется глюкоза. Это дает эффект стимулирования перемещения избыточной жидкости из крови в диализный раствор, который периодически сливают. Цель диализа
Цель диализа
Какой бы метод диализа не использовался, он преследует следующие цели: удаление продуктов обмена веществ, удаление лишней жидкости, корректировка электролитного дисбаланса и корректировка уровня pH организма.
В биохимия, диализ это процесс разделения молекулы в решение разницей в их скорости распространение через полупроницаемую мембрану, такую как диализная трубка. [1]
Концепция диализа была представлена в 1861 году шотландским химиком Томасом Грэмом. Он использовал эту технику для разделения растворенных веществ сахарозы (малая молекула) и гуммиарабика (большая молекула) в водном растворе. Он назвал диффундирующие растворенные вещества кристаллоидами и те, которые не проходят через мембрану коллоидами. [3]
Исходя из этой концепции, диализ можно определить как процесс самопроизвольного отделения взвешенных коллоидных частиц от растворенных ионов или молекул малых размеров через полупроницаемую мембрану. Чаще всего диализные мембраны изготавливаются из целлюлозы, модифицированной целлюлозы или синтетического полимера (ацетата целлюлозы или нитроцеллюлозы). [4]
Содержание
Принципы диализа
Из-за размера пор мембраны большие молекулы в образце не могут проходить через мембрану, тем самым ограничивая их диффузию из камеры для образца. Напротив, небольшие молекулы будут свободно диффундировать через мембрану и достичь равновесия по всему объему раствора, тем самым изменяя общую концентрацию этих молекул в образце и диализате (см. Диализный рисунок справа). После достижения равновесия конечная концентрация молекул зависит от объемов используемых растворов, и если уравновешенный диализат заменяется (или заменяется) свежим диализатом (см. Процедуру ниже), диффузия еще больше снизит концентрацию малых молекул. в образце.
Диализ можно использовать для введения или удаления небольших молекул из образца, поскольку небольшие молекулы свободно перемещаются через мембрану в обоих направлениях. Это делает диализ полезным методом для множества применений. Видеть диализная трубка для получения дополнительной информации об истории, свойствах и производстве полупроницаемые мембраны используется для диализа.
Наконец, ультрафильтрация, которая представляет собой конвективный поток воды и растворенных веществ вниз по градиенту давления, вызванному гидростатическими или осмотическими силами. При диализе ультрафильтрация удаляет из пробы молекулы отходов и лишние жидкости. [5] [6]
Диффузионный диализ
Электродиализ
Доннан Диализ
Обратный электродиализ
Электро-электродиализ
Процедура диализа
Оборудование
Общий протокол
Типичная процедура диализа образцов белка выглядит следующим образом:
Общий объем образца и диализата определяют конечную равновесную концентрацию малых молекул по обе стороны мембраны. Используя соответствующий объем диализата и многократные замены буфера, можно снизить концентрацию мелких загрязняющих веществ в образце до приемлемого или незначительного уровня. Например, при диализе 1 мл образца против 200 мл диализата концентрация нежелательных диализируемых веществ будет уменьшена в 200 раз при достижении равновесия. После двух дополнительных замен буфера по 200 мл каждая уровень загрязнения в образце снизится в 8 x 10 раз. 6 (200 х 200 х 200).
Оптимизация переменных и протокола
Хотя диализ образца относительно прост, универсальная процедура диализа для всех приложений не может быть предоставлена из-за следующих переменных:
Кроме того, конечная точка диализа в некоторой степени субъективна и зависит от приложения. Следовательно, общая процедура может потребовать оптимизации.
Мембраны для диализа и MWCO
Мембраны для диализа производятся и характеризуются согласно отсечка по молекулярной массе (MWCO) лимиты. В то время как мембраны с MWCO в диапазоне от 1 до 1000000 кДа коммерчески доступны, наиболее часто используются мембраны с MWCO около 10 кДа. MWCO мембраны является результатом количества и среднего размера пор, созданных во время изготовления диализной мембраны. MWCO обычно относится к наименьшей средней молекулярной массе стандартной молекулы, которая не будет эффективно диффундировать через мембрану во время расширенного диализа. Таким образом, диализная мембрана с молекулярной массой 10 кДа обычно удерживает более 90% белка с молекулярной массой не менее 10 кДа. [11] [12]
Важно отметить, что MWCO мембраны не является четко определенной величиной. Молекулы с массой, близкой к пределу MWCO мембраны, будут диффундировать через мембрану медленнее, чем молекулы, значительно меньшие, чем MWCO. Чтобы молекула могла быстро диффундировать через мембрану, она, как правило, должна быть по крайней мере в 20-50 раз меньше, чем рейтинг MWCO мембраны. Следовательно, нецелесообразно отделять белок 30 кДа от белка 10 кДа с помощью диализа через диализную мембрану, рассчитанную на 20 кДа.
Диализные мембраны для лабораторного использования обычно изготавливаются из пленки регенерированной целлюлозы или сложных эфиров целлюлозы. См. Ссылку для обзора целлюлозных мембран и производства. [13]
Форматы лабораторного диализа
Диализ обычно проводят в закрытых пакетах диализных трубок или в различных форматированных диализаторах. Выбор используемой схемы диализа во многом зависит от размера образца и предпочтений пользователя.Трубка диализа это самый старый и, как правило, наименее дорогой формат, используемый для диализа в лаборатории. Трубку разрезают и закрывают зажимом на одном конце, затем заполняют и запечатывают зажимом на другом конце. Трубки обеспечивают гибкость, но вызывают повышенное беспокойство относительно обращения, герметизации и извлечения проб. Трубки для диализа обычно поставляются влажными или сухими в рулонах или складчатых телескопических трубках.
Широкий выбор диализных устройств (или диализаторов) доступен от нескольких поставщиков. Диализаторы предназначены для определенных диапазонов объемов пробы и обеспечивают большую безопасность пробы, а также повышенную простоту использования и производительности при проведении диализных экспериментов по трубкам. Наиболее распространенными предварительно отформатированными диализаторами являются линейки продуктов Slide-A-Lyzer, Float-A-Lyzer и Pur-A-lyzer / D-Tube / GeBAflex Dialyzers.
Поставщики
Приложения
Диализ имеет широкий спектр применения. Их можно разделить на две категории в зависимости от типа используемого диализа.
Диффузионный диализ
Некоторые применения диффузионного диализа объясняются ниже.
Электродиализ
Некоторые применения электродиализа объясняются ниже.
Преимущества и недостатки
У диализа есть не только преимущества, но и недостатки. Следуя структуре предыдущего раздела, обсуждаются плюсы и минусы в зависимости от типа используемого диализа. Преимущества и недостатки как диффузионного диализа, так и электродиализа описаны ниже.
Диффузионный диализ
Основным преимуществом диффузионного диализа является низкое энергопотребление аппарата. Эта мембранная технология работает при нормальном давлении и не имеет изменения состояния, следовательно, требуемая энергия значительно снижается. В то же время это снижает и эксплуатационные расходы. Кроме того, необходимо отметить низкую стоимость установки, простоту эксплуатации, а также стабильность и надежность процесса. Еще один ключевой аспект, поскольку изменение климата в наши дни становится все более и более важным, заключается в том, что диффузионный диализ не загрязняет окружающую среду. [7]
Электродиализ
Основным недостатком электродиализа является ограничение плотности тока, процесс должен проводиться при более низкой плотности тока, чем максимально допустимая. Дело в том, что при приложении определенного напряжения диффузия ионов через мембрану не является линейной, что приводит к диссоциации воды, что снижает эффективность работы. Другой аспект, который следует принять во внимание, заключается в том, что, хотя для работы требуется низкая энергия, чем выше концентрация соли в исходном сырье, тем выше будет необходимая энергия. Наконец, в случае некоторых продуктов необходимо учитывать, что электродиализ не удаляет микроорганизмы и органические загрязнители, поэтому необходима дополнительная обработка. [19]
В биохимия, диализ это процесс разделения молекулы в решение разницей в их скорости распространение через полупроницаемую мембрану, такую как диализная трубка. [1]
Концепция диализа была представлена в 1861 году шотландским химиком Томасом Грэмом. Он использовал эту технику для разделения растворенных веществ сахарозы (малая молекула) и гуммиарабика (большая молекула) в водном растворе. Он назвал диффундирующие растворенные вещества кристаллоидами и те, которые не проходят через мембрану коллоидами. [3]
Исходя из этой концепции, диализ можно определить как процесс самопроизвольного отделения взвешенных коллоидных частиц от растворенных ионов или молекул малых размеров через полупроницаемую мембрану. Чаще всего диализные мембраны изготавливаются из целлюлозы, модифицированной целлюлозы или синтетического полимера (ацетата целлюлозы или нитроцеллюлозы). [4]
Содержание
Принципы диализа
Из-за размера пор мембраны большие молекулы в образце не могут проходить через мембрану, тем самым ограничивая их диффузию из камеры для образца. Напротив, небольшие молекулы будут свободно диффундировать через мембрану и достичь равновесия по всему объему раствора, тем самым изменяя общую концентрацию этих молекул в образце и диализате (см. Диализный рисунок справа). После достижения равновесия конечная концентрация молекул зависит от объемов используемых растворов, и если уравновешенный диализат заменяется (или заменяется) свежим диализатом (см. Процедуру ниже), диффузия еще больше снизит концентрацию малых молекул. в образце.
Диализ можно использовать для введения или удаления небольших молекул из образца, поскольку небольшие молекулы свободно перемещаются через мембрану в обоих направлениях. Это делает диализ полезным методом для множества применений. Видеть диализная трубка для получения дополнительной информации об истории, свойствах и производстве полупроницаемые мембраны используется для диализа.
Наконец, ультрафильтрация, которая представляет собой конвективный поток воды и растворенных веществ вниз по градиенту давления, вызванному гидростатическими или осмотическими силами. При диализе ультрафильтрация удаляет из пробы молекулы отходов и лишние жидкости. [5] [6]
Диффузионный диализ
Электродиализ
Доннан Диализ
Обратный электродиализ
Электро-электродиализ
Процедура диализа
Оборудование
Общий протокол
Типичная процедура диализа образцов белка выглядит следующим образом:
Общий объем образца и диализата определяют конечную равновесную концентрацию малых молекул по обе стороны мембраны. Используя соответствующий объем диализата и многократные замены буфера, можно снизить концентрацию мелких загрязняющих веществ в образце до приемлемого или незначительного уровня. Например, при диализе 1 мл образца против 200 мл диализата концентрация нежелательных диализируемых веществ будет уменьшена в 200 раз при достижении равновесия. После двух дополнительных замен буфера по 200 мл каждая уровень загрязнения в образце снизится в 8 x 10 раз. 6 (200 х 200 х 200).
Оптимизация переменных и протокола
Хотя диализ образца относительно прост, универсальная процедура диализа для всех приложений не может быть предоставлена из-за следующих переменных:
Кроме того, конечная точка диализа в некоторой степени субъективна и зависит от приложения. Следовательно, общая процедура может потребовать оптимизации.
Мембраны для диализа и MWCO
Мембраны для диализа производятся и характеризуются согласно отсечка по молекулярной массе (MWCO) лимиты. В то время как мембраны с MWCO в диапазоне от 1 до 1000000 кДа коммерчески доступны, наиболее часто используются мембраны с MWCO около 10 кДа. MWCO мембраны является результатом количества и среднего размера пор, созданных во время изготовления диализной мембраны. MWCO обычно относится к наименьшей средней молекулярной массе стандартной молекулы, которая не будет эффективно диффундировать через мембрану во время расширенного диализа. Таким образом, диализная мембрана с молекулярной массой 10 кДа обычно удерживает более 90% белка с молекулярной массой не менее 10 кДа. [11] [12]
Важно отметить, что MWCO мембраны не является четко определенной величиной. Молекулы с массой, близкой к пределу MWCO мембраны, будут диффундировать через мембрану медленнее, чем молекулы, значительно меньшие, чем MWCO. Чтобы молекула могла быстро диффундировать через мембрану, она, как правило, должна быть по крайней мере в 20-50 раз меньше, чем рейтинг MWCO мембраны. Следовательно, нецелесообразно отделять белок 30 кДа от белка 10 кДа с помощью диализа через диализную мембрану, рассчитанную на 20 кДа.
Диализные мембраны для лабораторного использования обычно изготавливаются из пленки регенерированной целлюлозы или сложных эфиров целлюлозы. См. Ссылку для обзора целлюлозных мембран и производства. [13]
Форматы лабораторного диализа
Диализ обычно проводят в закрытых пакетах диализных трубок или в различных форматированных диализаторах. Выбор используемой схемы диализа во многом зависит от размера образца и предпочтений пользователя.Трубка диализа это самый старый и, как правило, наименее дорогой формат, используемый для диализа в лаборатории. Трубку разрезают и закрывают зажимом на одном конце, затем заполняют и запечатывают зажимом на другом конце. Трубки обеспечивают гибкость, но вызывают повышенное беспокойство относительно обращения, герметизации и извлечения проб. Трубки для диализа обычно поставляются влажными или сухими в рулонах или складчатых телескопических трубках.
Широкий выбор диализных устройств (или диализаторов) доступен от нескольких поставщиков. Диализаторы предназначены для определенных диапазонов объемов пробы и обеспечивают большую безопасность пробы, а также повышенную простоту использования и производительности при проведении диализных экспериментов по трубкам. Наиболее распространенными предварительно отформатированными диализаторами являются линейки продуктов Slide-A-Lyzer, Float-A-Lyzer и Pur-A-lyzer / D-Tube / GeBAflex Dialyzers.
Поставщики
Приложения
Диализ имеет широкий спектр применения. Их можно разделить на две категории в зависимости от типа используемого диализа.
Диффузионный диализ
Некоторые применения диффузионного диализа объясняются ниже.
Электродиализ
Некоторые применения электродиализа объясняются ниже.
Преимущества и недостатки
У диализа есть не только преимущества, но и недостатки. Следуя структуре предыдущего раздела, обсуждаются плюсы и минусы в зависимости от типа используемого диализа. Преимущества и недостатки как диффузионного диализа, так и электродиализа описаны ниже.
Диффузионный диализ
Основным преимуществом диффузионного диализа является низкое энергопотребление аппарата. Эта мембранная технология работает при нормальном давлении и не имеет изменения состояния, следовательно, требуемая энергия значительно снижается. В то же время это снижает и эксплуатационные расходы. Кроме того, необходимо отметить низкую стоимость установки, простоту эксплуатации, а также стабильность и надежность процесса. Еще один ключевой аспект, поскольку изменение климата в наши дни становится все более и более важным, заключается в том, что диффузионный диализ не загрязняет окружающую среду. [7]
Электродиализ
Основным недостатком электродиализа является ограничение плотности тока, процесс должен проводиться при более низкой плотности тока, чем максимально допустимая. Дело в том, что при приложении определенного напряжения диффузия ионов через мембрану не является линейной, что приводит к диссоциации воды, что снижает эффективность работы. Другой аспект, который следует принять во внимание, заключается в том, что, хотя для работы требуется низкая энергия, чем выше концентрация соли в исходном сырье, тем выше будет необходимая энергия. Наконец, в случае некоторых продуктов необходимо учитывать, что электродиализ не удаляет микроорганизмы и органические загрязнители, поэтому необходима дополнительная обработка. [19]
