Что такое пцр в реальном времени
ПЦР-диагностика
Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) – это одно из самых ярких достижений в сфере молекулярной биологии. Метод получил широчайшее распространение в разных областях науки. Благодаря очень высокой специфичности и чувствительности, метод ПЦР применяется в медицине, биологии, ветеринарии, криминалистике, санитарной службе и других отраслях деятельности человека.
Для анализа методом ПЦР можно использовать любые биологические материалы, которые содержат нуклеиновые кислоты (молекулу ДНК или РНК).
Принцип ПЦР- исследования
Кому мы обязаны появлением метода ПЦР?
Со слов американского биохимика Керри Мюллиса (Kary Mullis), идея идентифицировать живые организмы по короткому участку их генетического кода (ДНК) пришла ему в голову в 1983 году, по пути с работы домой. А в основе этой идеи, лежала работа другого американского биохимика, Артура Корнберга (Arthur Kornberg), которая в свое время не нашла отклика у научного сообщества.
Керри допустил возможность того, чтобы взять молекулу ДНК какого-либо организма, с помощью высокой температуры «распустить» ее спираль на две нити, специфическими маркерами-праймеры пометить уникальные для этого микроорганизма участки ДНК и затем, применив фермент ДНК-полимеразу, создать из двух нитей две новые молекулы ДНК. Но уже содержащие в себе меченные праймеры. И потом останется просто искать эти участки в диагностическом материале.
В итоге, корпорация CETUS, в которой работал Мюлис, выделила ему команду ученых. И в 1985 году, в издании Американского общества генетики человека, появилась публикация с теоретическим обоснованием ПЦР, как метода идентификации генетического материала живых организмов.
Как это все происходит в лаборатории
Выделение ДНК
Элонгация
Или синтез. После завершения процесса отжига, в реакционной смеси создают условия для активности полимеразы. Фермент, ориентируясь на молекулы праймеров (а не исходных нуклеиновых кислот), начинает синтез новых ниток ДНК/РНК. Которые становятся копиями исходных, искомых молекул нуклеиновых кислот.
Такой температурный цикл проводится 30 и более раз. В результате, даже при изначально небольшом количестве искомого генетического материала, в реакционной смеси накапливается значительное число «помеченных» праймерами нуклеиновых кислот (растет экспоненциально, с удвоением при каждом цикле).Обнаружить большие количества ДНК/РНК намного проще, за счет чего реализуется еще одно преимущество ПЦР – высочайшая чувствительность.
Детекция
Оценка результатов ПЦР проводится несколькими путями:
Преимущества методики ПЦР
Всего разработано более 10 разных методик амплификации, применяемых лабораториями в зависимости от исходных условий и поставленных целей.
Общим для них есть высокая чувствительность (для положительного результата достаточно 40 (!) или менее искомых копий ДНК в 1 мл образца, то есть вероятность ложноотрицательного ответа ничтожно мала. И очень высокая специфичность: вероятность ложноположительного ответа составляет менее 1%.
Но точность результатов сильно зависит от качества сбора диагностического материала, тщательного соблюдения всех технических требований к каждому этапу и качеству оборудования, расходных материалов (буфера, праймеров, раствора для отмывки и т.д.).
Области применения в медицине
В дерматовенерологии ПЦР используют для выявления венерических заболеваний: микоплазменной, хламидийной инфекций, сифилиса, генитального герпеса и др.
Инфекционисты активно используют ПЦР для диагностики туберкулеза, ВИЧ, вирусных гепатитов, герпеса, мононуклеоза, вируса Эпштейн-Барр и др.). А с помощью ПЦР в реальном времени, оценивая вирусную нагрузку, врачи могут составить мнение о динамике заболевания, отклике на лечение, что особенно актуально для пациентов с ВИЧ, принимающих терапию.
Также благодаря ПЦР врачи могут в течение нескольких дней с уверенностью идентифицировать коклюш и паракоклюш, выявить возбудителей эпидемии ОРВИ. Уточняются типы вируса гриппа, циркулирующие на определенной территории, на основании чего появляется возможность разработать эффективную вакцину для каждого сезона гриппа.
В течение суток или быстрее можно установить вид возбудителя кишечной инфекции, а значит – назначить адекватное лечение и обнаружить вероятный источник заражения.
Летом, ПЦР актуальна для диагностики заболеваний, передаваемых иксодовыми клещами: боррелиоза (болезни Лайма), клещевых энцефалитов.
Метод позволяет работать с любым биологическим материалом. Гемотрансмиссивные инфекции (сифилис, ВИЧ, гепатиты, боррелиоз) исследуются по пробе венозной крови или спинномозговой жидкости. Кожные болезни (герпес, грибки) – по соскобу с пораженного участка. Венерические и урологические – по образцу мочи, спермы, влагалищного отделяемого.
Так что в медицине, ПЦР применяется везде, где нужна высокая точность и быстрота получения результатов.
Лабораторные исследования, выполняющиеся методом ПЦР:
Полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR)
Екимов А.Н., Шипулин Г.А., Бочкарев Е.Г. Рюмин Д.В.
ЦНИИ Эпидемиологии РФ
Принципиальной особенностью полимеразной цепной реакции в реальном времени является возможность детекции накопления продуктов амплификации непосредственно во время проведения амплификации. Так как кинетика накопления ампликонов напрямую зависит от числа копий исследуемой матрицы, это позволяет проводить количественные измерения ДНК и РНК инфекционных агентов. Полученная информация может быть использована для проведения мониторинга эффективности проводимой терапии, оценки клинического прогноза. В отличие от других методов количественного определения ДНК матрицы в пробе, ПЦР в реальном времени не требует дополнительных манипуляций, связанных с раститровкой ДНК исследуемой пробы или полученных в ходе ПЦР ампликонов, которые усложняют постановку анализа и могут приводить к появлению ложноположительных результатов. Подобный подход позволяет отказаться от стадии электрофореза, что ведет к резкому уменьшению вероятности контаминации исследуемых проб продуктами амплификации, а также позволяет снизить требования, предъявляемые к ПЦР лаборатории.
Широкое внедрение в область практического здравоохранения полимеразной цепной реакции (ПЦР) обусловлено простотой ее выполнения, низкой себестоимостью и надежностью. Вместе с тем, сегодня уже очевидно, что дальнейшее развитие ПЦР получит в области количественного определения нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) инфекционных агентов.
Количественное определение ДНК инфекционных агентов в ходе лечения позволяет получать информацию о правильности или безрезультатности проводимой терапии, помогает предсказывать периоды обострения заболевания и принимать адекватные меры для скорейшего излечения больного без нанесения ущерба для его здоровья, связанного с неэффективной терапией.
Существует большое количество способов получить данные о концентрации нуклеиновых кислот в пробе методом ПЦР, но все они требуют дополнительных трудоемких этапов работы, связанных с предварительной раститровкой выделенной из анализируемой пробы ДНК, или полученных в ходе ПЦР ампликонов, что приводит к увеличению времени, необходимого для постановки анализа и сложности интерпретации полученных результатов [2,5]. Также, наличие дополнительных этапов работы увеличивает вероятность ошибки и получения недостоверного результата.
ПЦР в реальном времени.
Отличительными чертами данного метода, в отличие от классической ПЦР, является возможность количественного определения ДНК/РНК инфекционных агентов в исследуемом материале, отсутствие стадии электрофореза, менее строгие требования к организации ПЦР-лаборатории и автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов.
Отсутствие стадии электрофореза позволяет минимизировать риск контаминации продуктами ПЦР и таким образом резко уменьшить число ложноположительных результатов. Поскольку регистрация результатов проводится непосредственно в процессе ПЦР, весь анализ можно проводить в одной-двух комнатах лаборатории и нет необходимости в отдельном помещении для детекции продуктов реакции.
Данная методика в течение последних пяти лет успешно применяется в крупнейших диагностических и научно-исследовательских центрах развитых стран мира и в ближайшее время станет так же широко распространена, как и ПЦР в ее сегодняшнем формате, благодаря экономии производственных площадей, уменьшению количества персонала и востребованности количественного определения ДНК/РНК.
Использование математических методов анализа позволяет проводить автоматическую интерпретацию полученных результатов и снимает проблему субъективной оценки электрофореграмм.
Для постановки ПЦР в реальном времени необходим специальный амплификатор, отличительной особенностью которого является возможность возбуждать и детектировать флуоресценцию, отражающую накопление ампликонов, на каждом цикле амплификации.
Детекция продуктов амплификации.
Для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени используют следующие наиболее распространенные подходы:
1. Выщепление 5′ концевой метки (TaqMan Assay).
Данная методика основана на использовании 5′-экзонуклеазной активности полимеразы. В реакционную смесь добавляют ДНК-зонды, в состав которых входит флуоресцентная метка в 5′-положении и гаситель флуоресценции в 3′-положении, а также фосфатная группа в 3′-положении. Эти зонды имеют места посадки внутри амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3′-положении блокирует полимеразу.
В ходе ПЦР во время стадии отжига праймеров происходит присоединение ДНК-зонда к комплементарной цепи ДНК, причем чем больше продуктов амплификации образуется в ходе ПЦР, тем больше молекул зондов свяжется с соответствующими ампликонами. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и при достижении зонда начинает его расщеплять благодаря наличию 5′-экзонуклеазной активности. Таким образом происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к увеличению детектируемого свечения [3]. Очевидно, что чем больше ампликонов было наработано в ходе ПЦР на данный момент времени, тем интенсивнее будет свечение.
2. Использование зондов с комплементарными концевыми последовательностями (molecular beacons).
Данная методика отличается от описанной выше тем, что концевые последовательности зонда представляют собой взаимно комплементарные области, поэтому при температуре отжига праймеров они схлопываются и образуют шпильки [6]. Внутренняя область зондов содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную амплифицируемой области. При отжиге праймеров зонды, не присоединившиеся к ДНК матрице, остаются в «схлопнутом» состоянии, так что происходит тушение флуоресценции.
Те же зонды, которые отжигаются на матрицу, разворачиваются, и флуоресцентная метка и гаситель расходятся в разные стороны. Таким образом, увеличивается интенсивность свечения.
3. Применение 2-х зондов с резонансным переносом энергии (LightCycler assay).
Данный способ детекции накопления продуктов амплификации отличается повышенной специфичностью, так как увеличение флуоресценции происходит при комплементарном связывании с ампликонами сразу 2-х ДНК зондов [1]. Принцип метода заключается в переносе энергии от одного флуорофора, находящегося на 3` конце первого зонда, ко второму флуорофору, находящемуся на 5` конце второго зонда, причем расстояние между флуорофорами составляет 1-3 нуклеотида.
При одновременном связывании обоих зондов с ДНК матрицей испускаемое первым флуорофором излучение передается на второй флуорофор, а его излучение детектируется прибором. Таким образом, возрастает специфичность анализа.
4. Использование интеркалирующих агентов.
Этот способ детекции основан на том факте, что флуоресценция бромистого этидия и SYBR Green I значительно возрастает при их внедрении в двухцепочечные молекулы ДНК [4]. Таким образом, можно наблюдать за накоплением продуктов амплификации.
Очень важно отметить то, что увеличение флуоресценции может быть связано как с накоплением специфического продукта, так и неспецифического (праймеры-димеры, шмер). Для получения корректных результатов необходимо дополнительное изучение полученных ампликонов с помощью построения так называемых «кривых плавления» (melting curves).
Для этого после окончания ПЦР реакционную смесь нагревают и непрерывно измеряют флуоресценцию. По достижении температуры плавления продукта амплификации флуоресценция резко снижается.
Каждое резкое уменьшение флуоресценции на графике соответствует числу полосок, получаемых на электрофорезе, то есть числу разных типов ампликонов. Для облегчения работы с полученной информацией проводят дифференциальный анализ кривой плавления. Такой способ визуализации полученных данных гораздо удобнее для понимания и анализа.
Применение кривых плавления не ограничивается только детекцией продуктов амплификации с помощью бромистого этидия и SYBR Green I. При использовании кривых плавления в системах с ДНК-зондами (Taq-man assay, beacons) возможно различать точечные мутации, расположенные внутри областей связывания ДНК-матрицы и зонда. Наличие таких мутаций способно привести к изменению температуры плавления зонда и к изменениям в графике кривой плавления [1]. Использование кривых плавления не требует от оператора амплификатора никаких дополнительных манипуляций с пробирками, а интерпретация полученных данных автоматизирована и формализована.
Подводя итоги стоит отметить следующее: использование ДНК-зондов в том или ином варианте является наиболее предпочтительным в свете повышения специфичности анализа. Однако к недостаткам зондов относится высокая стоимость, что делает работу по подбору зондов, праймеров и условий амплификации дорогостоящей. Вместе с тем, использование интеркалирующих агентов является очень простым и дешевым. Отпадает необходимость подбора специальных праймеров, зондов, так как можно пользоваться уже используемыми праймерами, эффективность работы которых уже проверена. Эти обстоятельства делают применение интеркалирующих агентов весьма привлекательным.
Как выявляют вирус COVID-19 с использованием ОТ-ПЦР в реальном времени?
Хотите узнать больше о деятельности МАГАТЭ? Подпишитесь на нашу ежемесячную электронную рассылку, чтобы быть в курсе самых важных новостей, получать аудио- и видеоматериалы и многое другое.
Один из наиболее широко используемых и точных лабораторных методов выявления нового коронавируса — ОТ-ПЦР в реальном времени. (Фото: МАГАТЭ)
В связи с распространением по всему миру вируса, вызывающего инфекцию COVID-19, МАГАТЭ в партнерстве с Продовольственной и сельскохозяйственной организацией Объединенных Наций (ФАО) предлагает странам свою поддержку и экспертные знания, чтобы помочь им использовать один из наиболее точных лабораторных методов обнаружения, отслеживания и изучения коронавируса — полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-ПЦР в реальном времени).
Но что такое ОТ-ПЦР в реальном времени? Как это работает? И как это связано с ядерными технологиями? Ниже мы представим общий обзор этого метода, расскажем о принципах его работы и кратко поговорим о вирусах и генетике.
Что такое ОТ-ПЦР в реальном времени?
ОТ-ПЦР в реальном времени — это основанный на ядерных технологиях метод выявления присутствия определенного генетического материала любого патогена, в том числе вируса. Первоначально для обнаружения искомого генетического материала использовались радиоактивные изотопные маркеры, но в результате последующего усовершенствования этого метода изотопные метки были заменены специальными маркерами, чаще всего флуоресцентными красителями. С помощью этого метода ученые могут увидеть результаты практически сразу, еще в процессе исследования; при применении обычной ОТ-ПЦР результаты доступны только после его завершения.
При том, что сейчас ОТ-ПЦР в реальном времени является наиболее широко используемым методом для выявления коронавирусов, многие страны все еще нуждаются в поддержке при внедрении и использовании этого метода.
Что такое вирус? Что такое генетический материал?
Вирус — это микроскопическая совокупность генетического материала, окруженного молекулярной оболочкой. Генетический материал может быть представлен либо ДНК, либо РНК.
ДНК — это состоящая из двух цепей молекула, которая встречается во всех организмах, таких как животные, растения и вирусы, и содержит генетический код или алгоритм того, как эти организмы строятся и развиваются.
РНК обычно представляет собой состоящую из одной цепи молекулу, которая копирует, транскрибирует и передает части генетического кода белкам, чтобы они могли синтезировать и выполнять функции, которые поддерживают жизнь и развитие организмов. Существуют различные типы РНК, которые выполняют копирование, транскрибирование и передачу.
Некоторые вирусы, такие как коронавирус (SARS-CoV-2), содержат только РНК, что означает, что они полагаются на проникновение в здоровые клетки для размножения и выживания. Оказавшись внутри клетки, вирус использует свой собственный генетический код (РНК в случае коронавируса) чтобы взять под контроль и «перепрограммировать» клетки так, чтобы они стали фабриками по производству вирусов.
Для того чтобы при помощи ОТ-ПЦР в реальном времени выявить на раннем этапе присутствие в организме вируса, такого как коронавирус, ученым необходимо преобразовать РНК в ДНК. Этот процесс называется «обратной транскрипцией». Это делается потому, что только ДНК можно копировать (или амплифицировать), что и является ключевой частью процесса ОТ-ПЦР в реальном времени, применяемого для выявления вирусов.
Ученые амплифицируют определенную часть транскрибируемой вирусной ДНК в сотни тысяч раз. Амплификация важна, поскольку вместо того, чтобы пытаться найти ничтожное количество вируса среди миллионов цепей генетической информации, ученые имеют достаточно большое количество заданных участков вирусной ДНК, чтобы точно подтвердить, что вирус присутствует.
Как работает ОТ-ПЦР в реальном времени применительно к коронавирусу?
Из тех частей тела, где скапливается коронавирус, например из носа или горла человека, берется образец для проведения исследования. Образец обрабатывают несколькими химическими растворами, которые удаляют вещества, такие как белки и жиры, и извлекают только присутствующую в нем РНК. Эта извлеченная РНК представляет собой смесь собственного генетического материала человека и РНК коронавируса, если она присутствует в образце.
C помощью определенного фермента в реакции обратной транскрипции РНК превращают в ДНК. Затем ученые добавляют дополнительные короткие фрагменты ДНК, которые комплементарны определенным частям транскрибированной вирусной ДНК. Эти фрагменты прикрепляются к заданным участкам вирусной ДНК, если вирус присутствует в образце. Некоторые из добавленных генетических фрагментов предназначены для построения цепей ДНК во время амплификации, в то время как другие предназначены для построения ДНК и добавления к цепям маркерных меток, которые затем используются для выявления вируса.
После этого смесь помещается в прибор для проведения ОТ-ПЦР. Прибор выполняет циклы изменения температуры, во время которых смесь нагревается и охлаждается для того, чтобы запустить определенные химические реакции, которые создают новые точные копии заданных участков вирусной ДНК. Цикл многократно повторяется, чтобы продолжить копирование заданных участков вирусной ДНК. После каждого цикла происходит удвоение количества по сравнению с предыдущим: две копии превращаются в четыре, четыре — в восемь и так далее. Обычно при проведении ОТ-ПЦР в реальном времени выполняется 35 циклов; это означает, что к концу процесса из каждой цепи вируса, присутствующей в образце, создается около 35 миллиардов новых копий участков вирусной ДНК.
По мере того как создаются новые копии вирусных участков ДНК, маркерные метки прикрепляются к цепям ДНК, а затем высвобождают флуоресцентный краситель, уровень которого измеряется вычислительным устройством прибора с выводом показателя в режиме реального времени на экран. Вычислительное устройство отслеживает уровень флуоресцентного сигнала в образце после каждого цикла. Превышение этим показателем определенного уровня флуоресценции является подтверждением присутствия вируса. Ученые также смотрят, сколько циклов требуется для достижения этого уровня для того, чтобы оценить тяжесть инфекции: чем меньше циклов, тем тяжелее вирусная инфекция.
Зачем использовать ОТ-ПЦР?
Метод ОТ-ПЦР в реальном времени имеет высокую чувствительность и точность, с его помощью можно поставить надежный диагноз всего за три часа, при том, что лабораториям для этого обычно требуется в среднем от 6 до 8 часов. По сравнению с другими имеющимися методами изоляции вирусов ОТ-ПЦР в реальном времени значительно быстрее и имеет меньшую вероятность контаминации образца или ошибок, поскольку весь процесс может быть выполнен в одной закрытой пробирке. Это по-прежнему самый точный имеющийся метод для выявления коронавируса.
Поскольку вирусы присутствуют в теле только в течение определенного временного отрезка, ОТ-ПЦР в реальном времени нельзя использовать для выявления инфекций, появлявшихся в прошлом, что важно для понимания развития и распространения вирусов. Для выявления, отслеживания и изучения инфекций, появлявшихся в прошлом, особенно тех, которые могли развиваться и распространяться без симптомов, необходимо использовать другие методы.
МАГАТЭ в партнерстве с ФАО уже более 20 лет обучает специалистов во всем мире использованию метода ОТ-ПЦР в реальном времени и предоставляет им соответствующее оборудование, в частности через свою Сеть лабораторий ветеринарной диагностики VETLAB. В последнее время этот метод также используется для диагностики других заболеваний, таких как Эбола, Зика, MERS-Cov, SARS-Cov-1 и других серьезных зоонозных инфекций и болезней животных. Зоонозные инфекции — это болезни животных, которые также могут передаваться человеку.
ПЦР-тестирование: как работает метод ПЦР в диагностике
ПЦР – высокоточный метод диагностики и одно из самых главных открытий в области биологии за последние десятилетия. ПЦР-анализ применяется уже почти 40 лет и считается наиболее точным и чувствительным способом диагностики инфекционных заболеваний.
ПЦР – уникальный и универсальный метод, тест используется не только в клинической лабораторной диагностике, но также в биологии, криминалистике, археологии и многих других научных областях. Все, что нужно для проведения анализа – небольшое количество любого биоматериала пациента.
Суть метода ПЦР
ПЦР – полимеразная цепная реакция. Метод основан на обнаружении даже небольших концентраций искомого элемента диагностики. Для определения изначально крайне малых концентраций РНК или ДНК, которые необходимо определить в процессе проведения основного этапа исследования, используется метод искусственного увеличения количества РНК или ДНК. А поскольку они специфичны и строго индивидуальны для каждого микроорганизма или живого существа за счет уникальности последовательности нуклеотидов во фрагментах, ошибка в определении целевого ДНК или РНК исключена.
Генетическая информация любого живого организма записывается в ДНК. Эта молекула состоит из двух цепочек, сплетающихся в единую спираль. Некоторые вирусы (например, COVID-19) хранят свой код в РНК – одной нити нуклеотидов.
Для каждого организма, включая вирусы, бактерии и грибки, последовательность нуклеотидов уникальна. Ее можно сравнить с отпечатком пальца или сканом сетчатки глаза человека. Укороченные последовательности нуклеотидов, характерные для каждого вида патогена (возбудителя опасных заболеваний), хранятся в базах научных лабораторий в виде праймеров – отдельных участков ДНК, типичных для только конкретного возбудителя. Эти участки значительно короче любой молекулы ДНК. Такие праймеры присоединяются к ДНК возбудителя в пробе и под действием катализаторов многократно воспроизводят свои дубли. Этот процесс называются «репликация» – многократное увеличение, дублирование искомого участка до тех пор, пока он не станет доступен для определения. Процесс репликации возможен только при наличии в пробе ДНК возбудителя.
Преимущества метода ПЦР
Какие есть недостатки
Показания к проведению ПЦР-анализа
Подготовка к проведению ПЦР-теста
Как проводится ПЦР-анализ
Результаты ПЦР-теста
Результаты анализов, проведенных методом ПЦР, известны уже через один день. Иногда возможно проведение экстренного теста – его часто используют при оказании срочной медицинской помощи при госпитализации. Тогда срок готовности результата сокращается до считанных часов.
Результаты ПЦР-теста дадут точную информацию о том, какая инфекция была обнаружена. При количественном тестировании анализ определит также вирусную или бактериальную нагрузку на организм. В этом случае в результатах будет значиться титр обнаруженного патогена (его количество в одном миллилитре пробы). Количественный анализ особенно важен при диагностике заболеваний, спровоцированных условно-патогенными микроорганизмами, которые присутствуют в норме практически у каждого человека. Такие микроорганизмы представляют угрозу только при большой численности, а в остальных случаях мирно сосуществуют с носителем.