Что такое репарация кожи
Биорепарация – новый способ стать моложе
Чтобы составить достойную конкуренцию пластической хирургии, в индустрии косметологии постоянно проводятся эксперименты, позволяющие создавать новые средства для борьбы с возрастными изменениями. Одной из самых успешных последних разработок является биорепарация. С помощью этой инъекционной процедуры можно добиться омоложения лица и решить многие проблемы, характерные для возрастной кожи.
Кому и когда проводить биорепарацию?
Биорепарация ориентирована в первую очередь на женщин старше 40 лет. Считается, что в этом возрасте инъекции уже не слишком эффективны, а положительного результата можно достичь только путем пластических операций. Есть в этом доля правды. Действительно, избавиться от глубоких морщин и ярко выраженного птоза лица с помощью введения гиалуроновой кислоты или различных мезококтейлей невозможно.
Но что насчет качества кожи? Пластическая операция не устранит пигментные пятна, сосудистые звездочки, обезвоженность и т.д. Зато с этими проблемами легко можно справиться с помощью правильно подобранного курса инъекций. Биорепарация как раз и направлена на активное увлажнение и улучшение состояния кожи. Кроме того, она:
Биорепарация более всего эффективна:
В чем разница между биорепарацией и биоревитализацией?
Биорепарацию часто путают с биоревитализацией и наоборот. Однако это совершенно разные процедуры, хотя они и имеют сходства. Среди основных различий следует выделить:
Как проводится биорепарация?
Перед непосредственным проведением биорепарации необходима предварительная консультация косметолога. Специалист осматривает кожу пациента, выявляя имеющиеся проблемы и подбирая оптимальный препарат и его дозировку. Нужно учитывать, что каждый препаратов содержит много разнообразных компонентов. Поэтому пациентам, у которых есть склонность к аллергии, лучше сделать предварительную кожную пробу, что позволит исключить вероятность нежелательных реакций во время инъекций.
После посещения косметолога следует подготовиться к инъекциям. Для этого необходимо устранить любые воспаления кожи лица, если они есть. Также желательно пропить курс противовирусных средств для профилактики появления герпеса, если имеется предрасположенность к нему. За неделю до биорепарации нужно воздержаться от алкогольных напитков, а также употребления препаратов, которые разжижают кровь. Это поможет снизить риск появления крупных гематом.
Биорепарация выполняется в условиях процедурного кабинета. Она начинается с тщательного очищения кожи. После на нее наносится обезболивающий крем и антисептик. Далее косметолог приступает к введению препарата. Как правило, биорепаранты вводятся папульной техникой, как и в случае с биоревитализацией. При таком методе выполняется много проколов по всей обрабатываемой зоне лица, в каждый из которых вводится небольшое количество препарата.
Положительный эффект можно увидеть в первые дни после проведения биорепарации. Гиалуроновая кислота практически сразу начинает разглаживать морщины и увлажнять кожу. Но максимальное преображение наступит не так быстро. Активные компоненты начнут действовать через несколько недель после процедуры. Как правило, для полноценного результата необходимо пройти от 3 до 6 сеансов. Причем интервал между ними должен составлять примерно месяц. Все это время эффект от биорепарации будет постепенно нарастать.
Таким образом, биорепарация – это эффективный способ омолодить кожу. В отличие от пластической хирургии, она не требует восстановительного периода и не вызывает сильных болевых ощущений. По окончании всего курса процедур у пациентов улучшается цвет лица, уменьшаются морщины, кожа становится более упругой и мягкой, а также устраняются ее различные дефекты.
Что такое репарация кожи
Новости
Биомеханическая репарация: скрытые возможности нашей кожи
Биомеханическая репарация: скрытые возможности нашей кожи
Современная косметология предлагает множество процедур по омоложению кожи, которые строятся на новейших методиках и разработках в области эстетической медицины. Сегодня мы поговорим о замечательной процедуре по поддержанию красоты и молодости нашей кожи – биомеханической репарации, которая выполняется в Ставрополе в клинике «Соло».
Биомеханическая репарация основана на удивительном свойстве нашей кожи – регенерации: способности вырабатывать дополнительный коллаген и эластин в ответ на травму. Именно благодаря этой регенеративной функции кожи после царапин и порезов на месте корочки мы видим «новую» кожу, нежную и молодую. Биомеханическая репарация запускает эту ответную реакцию организма на обработанном участке кожи.
Биомеханическая репарация выполняется специальным аппаратом с насадкой с тончайшими иглами, которые создают в коже микроперфорации, так называемую микротравму. Второй особенностью этой процедуры является возможность введения активных веществ в кожу одновременно с микроперфорированием. Специалист на консультации назначит вам необходимое действующее вещество. Самым популярным активным веществом по-прежнему является гиалуроновая кислота, эффективнейшее природное средство борьбы со старением. Во время процедуры биомеханической репарации возможно использование нескольких активных веществ, индивидуальный коктейль препаратов, например, можно одновременно вводить гиалуроновую кислоту для омоложения кожи и себостатик – вещество, уменьшающее выработку кожного сала. Микроперфорирование кожи сопровождается вибрацией, которая делает кожу более восприимчивой к вводимым веществам, а также дополнительно стимулирует микроциркуляцию крови в коже.
Процедура биомеханической репарации безболезненна, так как микроперфорации проводятся на глубину в несколько микрон, поэтому после процедуры не требуется восстановления кожи, более того, результат будет виден сразу! Биомеханическая репарация – это отличная возможность подготовиться к какому-то важному мероприятию в вашей жизни.
Биомеханическая репарация позволяет решить разноплановые проблемы за одну процедуру за счет сочетания различных активных веществ, вводимых в кожу. Процедура показана как профилактика старения, борьба с возрастными проявлениями, решение косметических проблем кожи, а также если ваша кожа выглядит «уставшей». Биомеханическая репарация отлично подойдет тем, кто не переносит болевые ощущения, в этом случае она может стать альтернативой биоревитализации и мезотерапии – инъекционным методикам. Одна процедура биомеханической репарации длится около 30 минут, и после нее вы сразу заметите положительные изменения:
Помимо этого процедура даст и внутренний эффект:
Самая популярная зона применения биомеханической репарации – это лицо и шея, но процедуру можно также проводить в зоне декольте, на руках и теле. В этом случае с помощью биомеханической репарации в сочетании с вводимыми активными веществами можно справиться с такими неприятными для женщин явлениями, как целлюлит, растяжки и дряблость кожи.
Чтобы закрепить достигнутый эффект, рекомендуется провести курс процедур биомеханической репарации. Количество процедур, а также активные вещества, наиболее подходящие вашей коже, определит специалист клиники «Соло» на консультации. Биомеханическая репарация – это прекрасная возможность подготовиться к предстоящим праздникам: Дню влюбленных, 23 февраля и 8 марта.
Ждем вас в клинике «Соло» на процедуру биомеханической репарации!
Что такое биорепарация
Хотя эликсир вечной молодости еще не создан, современная косметология позволяет женщинам дольше оставаться молодыми, устраняя морщины, дефекты кожи, пигментацию, снижение тонуса. Одной из наиболее эффективных омолаживающих процедур считается биорепарация. Курс процедур дает достаточно выраженный эффект, позволяет добиться впечатляющих эффектов минимальными воздействиями.
Содержание статьи:
Биорепарация: что это
Это инъекционная процедура – введение в кожу гиалуроносодержащих препаратов в смеси с витаминами, пептидами и аминокислотами. Такой коктейль позволяет восстановить естественный уровень увлажненности тканей, стимулирует синтез коллагена, омолаживает кожу, устраняет мелкие морщины и пигментацию. Курс процедур улучшает внешний вид, подтягивает овал лица, стимулирует повышение упругости тканей, уменьшает пигментацию.
Препараты вводятся в глубокие слои тканей, остаются в них на длительный срок, что повышает эффективность терапии. Действие аминокислот направлено на стимуляцию естественной выработки коллагеновых волокон. За счет действия пептидов разрушаются жировые клетки, подтягивается овал лица, уменьшается отек тканей.
Плюсы и минусы процедуры
Несомненными позитивными эффектами процедуры считаются:
Но, несмотря на все преимущества, биорепарация имеет определенные минусы:
Показания к биорепарации
Специалисты выделяют целый ряд показаний для проведения биорепарации. К ним относятся такие проблемы, как:
Биорепарация может проводиться и на других частях тела. Показаниями к ее проведению служат:
Противопоказания к биорепарации
Учитывая тот факт, что это инъекционная методика омоложения и устранения проблем кожи, она имеет и ряд противопоказаний:
Перед проведением биорепарации всегда проводится консультация врача с определением всех возможных противопоказаний к вмешательству.
Как проводится процедура
Для того чтобы эффект был стойким и выраженным, необходим курс из 3-5 процедур, проводимых каждые две-три недели. Длительность терапии определяется врачом-косметологом. В среднем, одна процедура занимает до часа (включая аппликационную анестезию).
Подготовка
Предварительно проводится очищение кожи, чтобы устранить любые загрязнения и бактерии, что снижает риск заноса инфекции во время инъекций. Введение препарата в ткани сопровождается болезненностью, поэтому врач применяет поверхностную анестезию – крем с обезболивающими веществами.
Этапы проведения
Препараты выпускаются в форме стерильных одноразовых шприцев с иглами. Врач показывает вам выбранный препарат, при вас вскрывает упаковку. Препараты вводятся внутрикожно и подкожно путем серии микроинъекций: на небольшом расстоянии друг от друга. В области введения образуются папулы (приподнятые бугорки).
После введения наносится крем для стимуляции процессов восстановления и снижения риска осложнения, усиления эффекта от инъекций. Врач дает рекомендации по уходу за кожей.
Какие препараты используются
Используются специальные составы для биорепарации. Их подбирают на основании показаний и пожеланий пациента, а также наличия в клинике.
Реабилитация после процедуры
Период восстановления короткий, сразу после процедуры можно возвращаться к привычной жизни. Важно помнить, что в местах введения игл остаются небольшие папулы, возможна отечность и легкие синячки.
Для предотвращения осложнений и побочных эффектов важно:
Возможные побочные эффекты и осложнения
Все возможные побочные эффекты можно разделить на две группы:
С какими процедурами лучше всего сочетается биорепарация
Другие косметические процедуры, с которыми одновременно может проводиться биорепарация, крайне ограничены. Допустимо применение следующих методик:
Что лучше: биорепарация или биоревитализация
Нередко пациенты путают между собой биоревитализацию и биорепарацию. Хотя определенные сходства у этих двух методик имеются (они обе инъекционные и при их проведении используются препараты на основе гиалуроновой кислоты), но это разные способы омоложения.
Различается состав вводимых коктейлей и принцип их влияния на ткани. При биоревитализации применяется гиалуроновая кислота без добавления к ней дополнительных компонентов. Методика направлена на восстановление гидрофильности тканей (водного баланса). Но эффект длится относительно недолго.
Препараты для биорепарации остаются в тканях на более длительное время (до нескольких недель) и активно стимулируют омоложение кожи за счет модифицированных форм гиалуроновой кислоты и пептидно-витаминных комплексов. А они, в свою очередь, стимулируют активный синтез новых волокон коллагена и эластина, активируют работу фибробластов, уменьшают активность пигментных клеток, устраняют пигментацию. Также коктейль из веществ обладает антиоксидантным и защитным действием.
Отличия биорепарации от биоревитализации
Кожа лица – одна из самых незащищённых областей человеческого тела, открытая воздействию множества внешних факторов 24 часа в сутки. Применение современных средств косметологии позволяет снизить уровень этого воздействия, однако исключить его полностью попросту невозможно. Высокий уровень загрязнённости воздуха, перепады температур, яркий солнечный свет, ветер, пыль – список можно продолжать очень долго. Вдобавок ко всему, кожа испытывает естественные возрастные изменения, противостоять которым ещё сложнее. В сочетании со стрессами, регулярно возникающими у жителей крупных городов, ведущих активную деятельность, негативный результат не заставляет долго себя ждать. XXI век подарил женщинам множество прогрессивных методов, позволяющих с небольшими усилиями, эффективно и безопасно улучшить состояние кожи и продлить её молодость на долгое время. Заслуженную популярность в последнее время приобрели два метода косметической терапии – биорепарация и биоревитализация. Рассмотрим особенности каждого метода.
Биорепарация в деталях
Процедура биорепарации имеет множество показаний. Среди них проблемы с пигментацией, дефекты кожного покрова (шрамы, рубцы, угри), небольшие морщинки, растяжки и устранение последствий неудачных косметических процедур.
Принцип воздействия заключается в восстановлении гладкой упругой кожи за счёт регенерации коллагена и эластина в слоях эпидермиса, что, в конечном счёте, приводит к процессу обновления. Для этого под кожу вводится препарат, представляющий из себя смесь витаминов (к примеру, витамин С улучшает оттенок кожи и обладает свойствами антиоксиданта, а рибофлавин помогает усваиваться кислороду), минеральных элементов, аминокислот (обеспечивают интенсивную защиту от негативного воздействия) и белков. Производители фармацевтической продукции предлагают широкий спектр специализированных препаратов для инъекций:
Отличия биорепарации от биоревитализации
При биорепарации препараты, применяемые при инъекциях, в сумме составляют активный питательный комплекс, в котором компоненты взаимодействуют друг с другом, дополняя эффект, стимулируя обменные процессы и создавая дополнительный защитный барьер. Как и в случае с биоревитализацией, присутствует ряд ограничений и противопоказаний для применения: ослабленный иммунитет, воспалительные процессы, онкологические заболевания и обострение хронических, беременность и период грудного вскармливания.
Помочь в принятии окончательного решения относительно подходящей методики лечения, подобрать препараты и профессионально выявить индивидуальную непереносимость тех или иных компонентов сможет специалист по пластической хирургии в ходе первичного приёма и проведения необходимых лабораторных анализов.
Фибробласты и влияние на них препарата Meso–Wharton P199™: экспериментальные исследования
С. Г. Морозов, доктор мед. наук, член-корреспондент РАН, профессор, ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии, ГБОУ ДПО Российская медицинская Академия последипломного образования
Е. Н. Волкова, доктор мед. наук, профессор, врач-дерматовенеролог, директор Научно-образовательного департамента «Премьер Фарм»
И. Н. Сабурина, доктор биол. наук, ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии, ГБОУ ДПО Российская медицинская Академия последипломного образования
И. М. Зурина, младший науч. сотр. ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии
Н. В. Кошелева, канд. биол. наук, ведущий науч. сотр. ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии, Биологический факультет Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова
А. А. Горкун, канд. биол. наук, ведущий науч. сотр. ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии
К. В. Кожина, врач-косметолог, сертифицированный тренер «Премьер Фарм»
Введение
Старение – сложный биологический процесс, характеризующийся структурными, функциональными и обменными изменениями клеточных структур тканей. В отличие от внутренних органов, старение которых происходит достаточно скрытно, признаки этого процесса на коже всегда заметны.
Патоморфологически старение кожи характеризуется уменьшением ее толщины, снижением количества фибробластов, их размеров, скорости пролиферации, сглаживанием дермально-эпидермальной границы. Снижение синтетической активности клеток дермы приводит к уменьшению продукции ими таких важных компонентов основного вещества дермы, как коллагены, гликозаминогликаны, фибронектин и эластин (1, 2).
В настоящее время существует ряд препаратов для коррекции возрастных изменений кожи на клеточном уровне. К используемым препаратам предъявляются строгие требования: они должны быть безопасны, не аллергенны, эффективны, рентабельны, удобны в применении. Этим высоким требованиям отвечает инъекционный препарат Meso-Wharton P199™, предназначенный для интенсивной «репарации» кожи. Ключевой компонент препарата – Wharton Jelly Peptide P199 (P199) – синтетический аналог эмбрионального пептида, именно этот пептид инициирует глубокие, стойкие антивозрастные и регенерационные эффекты в коже.
Для подтверждения anti-age эффективности Meso-Wharton P199™ могут быть использованы разные объекты исследования – культуры клеток: кератиноциты, эндотелиальные клетки, меланоциты и дермальные фибробласты человека (3). Дермальные фибробласты представляют собой гетерогенную клеточную популяцию мезенхимного ряда и играют ключевую роль в регуляции процессов гомеостаза и восстановления кожного покрова. Они формируют оптимальные условия для пролиферации и функционирования других типов клеток (кератиноцитов, эндотелиальных, клеток волосяных фолликулов), регулируя клеточные взаимодействия (4, 5). Фибробласты продуцируют проколлаген, фибронектин, проэластин, гликозаминогликаны и ламинин, участвуют в формировании базальной мембраны кожи, продуцируют и выделяют в межклеточное пространство цитокины и факторы роста (6, 7). Также фибробласты играют важную роль в процессах эпителизации и заживления ран (8, 9). Поэтому они являются основной мишенью воздействия активных веществ, направленных как на омоложение кожи, так и на ее репарацию (10, 11).
Известно, что при длительном культивировании фибробластов происходит репликативное старение культуры. Старение культуры фибробластов in vitro максимально близко отражает изменения, присущие старению кожи in vivo. Вместе с тем последние исследования показали, что при длительном культивировании в монослое клетки теряют не только способность синтезировать белки внеклеточного матрикса, но и возникает риск накопления в клетках хромосомных аберраций (12). Кроме того, культивирование клеток в монослое не является естественным, изменяет характеристики клеток и не отражает реальные механизмы функционального состояния соматических клеток. При длительном культивировании в монослое клетки теряют одно из важнейших свойств своей функциональной активности – эпителио-мезенхимо-эпителиальную пластичность (13, 14, 15). 3D-культура (сфероиды) по своим свойствам более полно повторяет нативную ткань по плотности клеток на единицу объема и представляет собой динамичную систему с организованным клеточным поведением – необходимым условием полноценного морфогенеза.
Цель нашего исследования заключалась в комплексном, многоплановом изучении влияния препарата Meso–Wharton P199™ как на 2D-, так и в 3D-культурах дермальных фибробластов человека.
Материалы и методы
Первичную культуру дермальных фибробластов получали из биоптатов кожи посредством механической дезагрегации и последующей ферментативной обработки. Для этого биоптат промывали фосфатно-солевым буфером, содержащим антибиотик (гентомицин) и обрабатывали раствором трипсина. Затем пипетировали, в результате чего освобождали клетки от матрикса, центрифугировали, отмывали от раствора трипсина и ресуспендировали в культуральной среде DMEM/F12, содержащей 10 % сыворотки. Высевали на чашки Петри в плотности 1 × 105 – 2 × 105 клеток/см2 и помещали в стандартные условия инкубирования (+ 37 0С, 5 % СО2). Культивировали до 4-го пассажа, охарактеризовывали по экспрессии характерных маркеров и криоконсервировали, создавая банк первичной культуры дермальных фибробластов человека, на которой проводили все дальнейшие исследования. Использование в исследовании одной и той же первичной культуры клеток позволяет сопоставлять и сравнивать полученные данные.
Для получения «стареющей» культуры клетки из полученного ранее банка размораживали методом быстрого оттаивания при +37 0С, отмывали от остатков сыворотки и ДМСО раствором Хенкса с помощью центрифугирования в течение 7 мин. при 1000 g. Супернатант удаляли, полученный осадок из клеток ресуспендировали в полной ростовой среде, высевали на чашки Петри и помещали в стандартные условия инкубирования (+ 37 0С, 5 % СО2). Культивировали до 18-го пассажа, когда становились хорошо заметны все признаки репликативного старения дермальных фибробластов. Размороженная, не пассированная культура клеток 4-го пассажа (Р4) считалась контрольной и соответствовала по своим характеристикам фибробластам молодой кожи.
Для исследования дозозависимости препарата Meso-Wharton P199™ на 2D-культуре аликвоты (500 мкл) пептида P199, растворенного в солевом буфере, смешивали с полной ростовой средой в соотношении 1:2, 1:10, 1:100, 1:1000. Анализ цитотоксичности проводили на 2D-культуре дермальных фибробластов 18-го пассажа (Р18). Клетки помещали на 12-луночные планшеты в плотности 10 000 клеток на лунку. В качестве контроля исследовали поведение клеток в полной ростовой среде без добавления пептида. Клетки культивировали в присутствии пептида в течение 72 ч., далее окрашивали растворами Hoechst 33258 (0,004 мг/мл) и йодида пропидия PI (0,001 мг/мл), с помощью которого оценивали жизнеспособность клеток по проникновению в их ядро PI под инвертированным флуоресцентным микроскопом Olympus CKX41 (Olympus, Япония).
Анализ биоактивности проводили на 2D-культуре дермальных фибробластов и помещали на покровные стекла в чашки Петри (35 мм). Исследовали морфологию клеток и экспрессию характерных для фибробластов маркеров: цитокератина 19, эластина, α-гладкомышечного актина (αSMA), PCNA (маркера пролиферации), коллагенов I, III и IV типов. В качестве контроля культивировали клетки 18-го пассажа в полной ростовой среде без добавления препарата. Для проведения иммуноцитохимического анализа клетки культивировали в присутствии пептида в течение 72 ч., далее фиксировали в 4 % растворе параформальдегида (4 0С, 20 мин.). Затем стекла инкубировали с первичными антителами к цитокератину 19, эластину, α-гладкомышечному актину (αSMA), PCNA (маркеру пролиферации), коллагенам I, III и IV. Результат визуализировали с помощью вторичных антител, конъюгированных с флуорохромами FITC (E=525 nm) и DyLight594 (E=617 nm). Ядра докрашивали раствором Hoechst 33258 (0,004 мг/мл). Анализ проводили с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Olympus Fluoview FV10 (Olympus, Япония).
Для изучения влияния препарата Meso-Wharton P199™ на образование сфероидов из дермальных фибробластов исследовали монослойные клеточные культуры фибробластов Р18, которые культивировали с добавлением в ростовую среду препарата Meso–Wharton P199™ и культуры фибробластов Р18, культивируемые без добавления препарата Meso-Wharton P199™. Для данного этапа исследования использовали аликвоты (500 мкл) пептида р199, растворенного в солевом буфере, и смешаные с полной ростовой средой в соотношении 1:10. Фибробласты культивировали в течение 72 ч., отмывали от ростовой среды раствором Версена, затем обрабатывали 0,25 % раствором трипсина и снимали с чашек. Подсчитывали количество клеток в суспензии и центрифугировали. Осадок ресуспендировали в полной ростовой среде и помещали на агарозные планшеты в концентрации 1 × 103 клеток в лунку. Агарозные планшеты помещали в 12-луночные культуральные планшеты и вели прижизненное наблюдение в стандартных условиях камеры прибора Cell-IQ (СМ Technologies, Финляндия) в течение семи дней. Фоторегистрацию осуществляли каждые 20 мин. с помощью программы Cell-IQ Imagen, обработку изображений проводили в программном пакете Cell-IQ Analyzer. Положительным контролем считали формирование сфероидов из фибробластов 4-го пассажа (Р4) в полной ростовой среде без добавления пептида.
Результаты и обсуждение
В культуре дермальных фибробластов 18-го пассажа, которые использовали для дальнейших исследований как стареющую, были хорошо заметны все признаки репликативного старения: спонтанное увеличение размера клеток, преобладание крупных плащевидных и парусовидных клеток (Рис. 1а). Темпы клеточного деления резко снижались. Контрольная культура (Р4) соответствовала по своим характеристикам фибробластам молодой кожи. В ней преобладали небольшие веретеновидные клетки, которые хорошо пролифелировали (Рис. 1б).
Рис. 1. Культуры дермальных фибробластов, используемые для дальнейшего исследования.
а – опытная культура фибробластов (Р18) – соответствует зрелой (стареющей) кожи;
б – контрольная культура фибробластов (Р4) – соответствует молодой коже
По экспрессии характерных для фибробластов маркеров культура 18-го пассажа (Р18) также соответствовала возрастным изменениям, наблюдаемым в коже in vivo. Контрольные клетки активно экспрессировали характерные для фибробластов маркеры (цитокератина 19, эластина, коллагенов I, III и IV типов), отвечающие за основные биомеханические свойства кожи, такие как гладкость, упругость, эластичность (Рис. 2а, б, в), а в опытной культуре (Р18) экспрессия маркеров заметно снижалась по сравнению с контрольной культурой (Рис. 3а, б, в).
Рис. 2. Контрольная культура фибробластов (Р4)
а – экспрессия маркеров цитокератина-19, эластина;
б – экспрессия маркеров коллагена III типа;
в – экспрессия маркеров коллагена I типа
Рис. 3. Опытная культура фибробластов (Р18)
а – экспрессия маркеров цитокератина-19, эластина;
б – экспрессия маркеров коллагена III типа;
в – экспрессия маркеров коллагена I типа
Результаты исследования дозозависимости препарата Meso-Wharton P199™ на 2D-культуре показали, что предлагаемые разведения 1:10, 1:100 и 1:1000 не оказывали цитотоксического действия на культуру дермальных фибробластов человека. Учитывая отсутствие морфологических и цитотоксических различий эффекта препарата при разведениях, для исследования биоактивности препарата Meso-Wharton P199™ использовали разведение: 1:10.
Эластин, объем которого составляет всего 2 % от общего объема белков дермы, наряду с коллагеновыми волокнами придает ей упругость и эластичность. К 50-летнему возрасту в большинстве эластических волокон наблюдаются дегенеративные изменения за счет снижения синтеза эластина фибробластами. Поэтому экспрессия фибробластами эластина является одним из основных маркеров старения кожи.
Коллаген – фибриллярный секреторный белок, наиболее распространенный в организме человека. Он образует волокна, переплетающиеся как нити в ткани. Коллаген и эластин формируют волокнистый каркас, в который могут врастать новые клетки, и обеспечивают коже упругость и эластичность, а нарушение их синтеза приводит к потере этих свойств. По морфологии коллаген принято делить на три группы: фибриллярный коллаген: коллагены I, II, III, V типов; сетевидный коллаген – коллаген IV типа, образующий опорную сеть базальных мембран; нитевидный коллаген – коллаген VI типа.
В дерме взрослого человека интерстициальный фибриллярный коллаген (I и III типы) является самой большой фракцией коллагена и составляет 70 % от сухой массы дермы. При этом содержание коллагена I типа составляет 80 %, а III типа – приблизительно 15 % от всего объема коллагена. На протяжении всей жизни человека содержание коллагенов уменьшается примерно на 1 % в год.
Иммуноцитохимическое окрашивание на характерные для фибробластов маркеры в нашем исследовании показало, что экспрессия цитокератина-19 и эластина в культуре дермальных фибробластов человека Р18, отвечающих за упругость и эластичность кожи, увеличивается после сокультивирования с препаратом Meso-Wharton P199™, по сравнению с контрольной группой (Рис. 4а, б, в).
Монослойные клеточные культуры являются признанной модельной системой, используемой в разработке и исследованиях лекарственных средств. Однако такая 2D-клеточная модель отличается от естественных условий. Обычная адгезивная культура представляет собой растущие двумерным (2D) монослоем клетки на плоской поверхности. Клетки, прикрепленные к искусственной пластиковой или стеклянной подложке, контактируют с другими клетками с образованием межклеточных контактов только в одной плоскости, что препятствует формированию многомерной структуры. Все органы и ткани, включая кожу, имеют трехмерную клеточную организацию, в которой клетки взаимодействуют друг с другом, образуя сложные комплексы контактов с другими клетками и внеклеточным матриксом, формируя таким образом уникальное микроокружение. Поэтому «старение» монослойной культуры фибробластов in vitro во многом сходно, но неполностью эквивалентно старению кожи in vivo. Воспроизвести все возрастные изменения на монослойной культуре в полном объеме не удается. Это приводит исследователей к переводу модельных систем из 2D- в 3D-условия культивирования. Одним из вариантов 3D-клеточных культур являются сфероиды. Они представляют собой трехмерные самоорганизующиеся в силу природных адгезивных свойств сферические кластеры клеток. При формировании сфероидов клетки могут восстановить межклеточные контакты и создать микроокружение, поддерживающее их нативный фенотип. Однако не все клетки могут образовывать сфероиды. Низкодифференцированные клетки человека, включая «незрелые» фибробласты, в условиях отсутствия адгезии способны агрегировать друг с другом, формируя новую многоклеточную структуру – сфероид, содержащий эпителиальный и мезенхимный компоненты. Стареющие культуры фибробластов способность к сфероидообразованию утрачивают. Для сфероидообразования важен определенный уровень экспрессии фибронектина и интегринов α5 и β1 фибробластами. Дифференцировка и последующее старение клеток сопровождаются утратой способности к мезенхимо-эпителиальному переходу, без которого невозможно формирование сфероидов. Таким образом, сфероидообразование является уникальной простой количественной тестовой системой для определения клеточной зрелости и оценки влияния на нее исследуемых препаратов.
Кроме того, 3D-клеточные культуры более стабильны, чем 2D-клеточные культуры. Их можно поддерживать в культуре в течение длительного времени – более 3 месяцев, в отличие от монослойных культур, которые быстро достигают конфлуентного состояния и требуют постоянного пересева или при отсутствии пролиферации («старые» культуры) погибают. Поэтому именно 3D-культуры стали активно использовать при изучении отсроченных эффектов лекарственных препаратов.
На рис. 5 представлена сборка отдельных фотографий на сроках: 12 часов, 24 часа, 3, 5 и 7 суток. Видно, что при сокультивировании культуры фибробластов Р18 с препаратом Meso–Wharton P199™, смешанного с ростовой средой, уже через 12 часов наблюдается образование рыхлого сфероида. В течение последующих дней происходит компактизация клеток и уплотнение сфероида, которое заканчивается к 7 суткам культивирования. В отличие от сфероидов, образованных из фибробластов Р4, размеры образованных сфероидов из фибробластов Р18 через 7 суток немного больше, даже после компактизации. Вероятно, это связано с большим размером клеток в культуре фибробластов Р18. Из культуры фибробластов Р18, культивированных без пептида, через 12 часов образуется рыхлый агрегат, который при дальнейшем культивироании не компактизуется, а остается рыхлым с темной некротической зоной внутри сфероида и рыхлым наружным слоем, состоящим из дебриса. Возможно, клетки не могут синтезировать достаточное количество внеклеточного матрикса для образования межклеточных контактов и последующего образования сфероида.
Рис. 5. Влияние препарата Meso–Wharton P199™ на образование сфероидов из дермальных фибробластов в условиях 3D-культивирования. Световая фазово-контрастная прижизненная цейтраферная микроскопия
Исследование способности образовывать сфероиды показало, что присутствие в ростовой среде препарата Meso-Wharton P199™ стимулирует «омоложение» клеток и последующее восстановление мезенхимо-эпителиальной пластичности культивированных фибробластов за счет восстановленной способности синтезировать в достаточном для установления межклеточных контактов количестве компонентов внеклеточного матрикса (фибронектина и коллагенов), что влияет на способность формировать сфероиды. Результаты иммуноцитохимического исследования сформированных сфероидов, представленные далее, подтвердили наше предположение по восстановлению экспрессии компонентов внеклеточного матрикса. Было показано, что в сфероидах, культивированных в ростовой среде с добавлением препарата, практически все клетки экспрессировали эластин (Рис. 6а, б, в), а поверхностные клетки активно экспрессировали цитокератин-19 –белки внеклеточного матрикса, поддерживающие упругость кожи (Рис. 7а, б, в).
Рис. 6. Экспрессия эластина
а – сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом Meso–Wharton P199™;
б – сфероид из фибробластов Р18 без препарата Meso–Wharton P199™;
в – сфероид из фибробластов Р4 (контроль)
Рис. 7. Экспрессия цитокератина-19
а – сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом Meso–Wharton P199™;
б – сфероид из фибробластов Р18 без препарата Meso–Wharton P199™;
в – сфероид из фибробластов Р4 (контроль)
Препарат не оказывал ключевого влияния на экспрессию коллагенов I и III типов. Практически все клетки сфероидов экспрессировали эти коллагены. Однако при исследовании влияния на экспрессию коллагена IV типа было обнаружено, что после сокультивирования с препаратом р199 практически все клетки в сфероиде экспрессировали этот коллаген. Очевидно, анализируемый препарат активно стимулирует в фибробластах выработку коллагена IV – основного компонента базальной мембраны эпидермиса, дефицит которого приводит к старению кожи и развитию в ней патологических процессов (Рис. 8а, б, в). Также было установлено, что препарат 199 положительно влияет на уровень экспрессии фибронектина (Рис. 9а, б, в), который вместе с гликозаминогликанами составляют аморфный (основной) компонент межклеточного матрикса. Кроме того, фибронектин отвечает за адгезию, подвижность, дифференцировку и взаимную ориентацию клеток (6).
Рис. 8. Экспрессия коллагена IV типа
а – сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом Meso–Wharton P199™;
б – сфероид из фибробластов Р18 без препарата Meso-Wharton P199™;
в – сфероид из фибробластов Р4
Рис. 9. Экспрессия фибронектина
а – сфероид из фибробластов Р18 после сокультивирования с препаратом Meso-Wharton P199™;
б – сфероид из фибробластов Р18 без препарата Meso–Wharton P199™;
в – сфероид из фибробластов Р4
Заключение
Результаты данного исследования убедительно продемонстрировали эффективность применения препарата Meso-Wharton P199™ для омоложения кожи.